罗清勇 冯鹏 张宗平

前列腺癌占全球所有癌症病例的12%，是男性中第二常见的癌症[1]。对于前列腺癌的治疗，主要使用放射疗法或根治性前列腺切除术和激素消融疗法，然而，这些方法不能提高患者的存活率，并且近30%的患者经历了根治性前列腺切除术后复发[2]，因此，与前列腺癌发生相关分子机制的全面表征是十分必要的[3]，有助于提高患者的生存和增加当前治疗选择。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是转录后调控基因表达的小型非编码RNA，是非编码基因组的一部分。大量数据表明，miRNA是许多疾病(包括癌症)的潜在生物标志物，其异常表达与前列腺癌的潜在机制有关[4,5]。有研究用miRNA芯片技术对正常前列腺组织和前列腺癌组织进行筛选，发现miR-320e在前列腺癌组织中的表达明显上调[6,7]，并发现miR-320e高表达可增强胰腺癌细胞耐药性、促进细胞增殖[8]，但miR-320e对前列腺癌细胞生物学行为的影响及其机制尚不清楚。基于此，本研究以体外培养的前列腺癌细胞DU145为对象，评价miR-320e在前列腺癌细胞增殖和凋亡中的作用，并利用生物学信息预测其可能的靶基因脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad，FHIT)，旨在揭示miR-320e影响前列腺癌细胞增殖和凋亡的相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 前列腺癌细胞DU145和前列腺正常上皮细胞RWPE-1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、RIPA裂解液购自美国Sigma公司，miR-320e、anti-miR-320e、pcDNA3.1-FHIT、si-FHIT、双荧光素酶载体购自上海GenePharma公司，TRIzol、逆转录试剂盒、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，qPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购自美国Millipore公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)蛋白抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，FHIT抗体购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自博士德生物公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。

1.2 细胞培养 DU145和RWPE-1细胞复苏后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，放在73℃、5%CO2的培养箱中培养，每周换液2～3次。细胞密度为70%左右时，使用胰酶消化、传代。

1.3 实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测miR-320e表达 利用TRIzol试剂提取DU145和RWPE-1细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书的指示，合成cDNA，在ABI 7500荧光定量PCR仪中检测miR-320e水平，收集Ct值，以2-ΔΔCt法计算miR-320e表达量。miR-320e正向引物序列5’-GGCCTTCTCTTCCCAGTTCTT-3’，反向引物序列5’-TCACCTTCTCAACCCAGCTTT-3’。内参U6正向引物序列5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.4 细胞转染 选取处于对数生长期的DU145细胞，以1×105个/ml的密度接种于6孔板。细胞密度为约70%时，根据Lipofectamine 2000试剂说明书，将miR-320e、anti-miR-320e、pcDNA3.1-FHIT、si-FHIT和相应的阴性对照转染入DU145细胞，转染4～6 h，更换为含10%胎牛血清的新鲜培养基继续培养，备用。

1.5 靶基因预测及双荧光素酶报告基因实验 TargetScan网站(http://www.targetscan.org/)预测发现FHIT的3’非编码区(3’untranslated region，3’UTR)部分碱基可与miR-320e形成互补配对。为了证实miR-320e与FHIT的靶向关系，分别构建含有miR-320e结合位点的野生型FHIT(WT- FHIT)和突变型(MUT- FHIT)3’UTR荧光素酶报告载体，并分别与miR-320e或anti-miR-320e共转染，培养48h后，检测双荧光素酶活性。

1.6 蛋白质印迹法(Western blot)检测目的蛋白表达 为检测目的蛋白表达，使用RIPA裂解液充分提取DU145细胞总蛋白，取等量蛋白样品上样，经10%的SDS-PAGE分离蛋白，转移到PVDF膜，室温条件下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax、FHIT蛋白一抗(稀释度为1∶1 000)，4℃条件下孵育过夜，次日用Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween,TBST)洗膜15 min，漂洗3次，加入二抗(稀释度为1∶5 000)，室温条件下孵育1 h，TBST洗膜15 min，漂洗3次，加入化学发光液显影，以GAPDH作为内参，分析CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax、FHIT蛋白表达。

1.7 MTT法检测细胞增殖 DU145细胞按5×104个/ml的密度接种于96孔板，在培养箱中分别孵育24 h、48 h、72 h，培养结束后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培养箱孵育4 h，加入150 μl二甲基亚砜，37℃摇床震荡10 min，酶标仪读取DU145细胞吸光值(波长为490 nm)，以吸光值表示细胞活性(490 nm)。

1.8 细胞凋亡实验 细胞凋亡率的检测依据Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书的步骤进行。转染后的DU145细胞使用胰酶消化，离心收集1×105个细胞，加入500 μl缓冲液使细胞悬浮，加入5 μl Annexin V-FITC混匀，加入5 μl PI混匀，避光反应15 min，进行流式细胞仪的观察和检测。

2 结果

2.1 miR-320e在前列腺正常上皮细胞RWPE-1和前列腺癌细胞DU145中的表达 qPCR检测结果发现，与前列腺正常上皮细胞RWPE-1相比，前列腺癌细胞DU145中miR-320e表达量明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 miR-320e在细胞RWPE-1和细胞DU145中的表达

2.2 抑制miR-320e表达对细胞DU145增殖、凋亡的影响 在DU145细胞中转染anti-miR-320e，miR-320e表达量远低于anti-miR-NC组(P<0.05)，表明成功构建抑制miR-320e表达的细胞。MTT检测细胞DU145增殖，数据显示，抑制miR-320e表达较anti-miR-NC组明显降低DU145细胞24 h、48 h、72 h时的细胞活性(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明，抑制miR-320e表达较anti-miR-NC组明显增加细胞DU145的凋亡率(P<0.05)。Western blot测定增殖、凋亡相关蛋白表达，发现与anti-miR-NC组比较，抑制miR-320e表达明显减少Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量，显著提高P21、Bax蛋白水平(P<0.05)。见图1，表2、3。

图1 抑制miR-320e表达对细胞DU145增殖、凋亡的影响;A：抑制miR-320e表达对细胞DU145凋亡的影响;B：抑制miR-320e表达对细胞DU145增殖、凋亡蛋白表达的影响

表2 抑制miR-320e表达对细胞DU145增殖、凋亡的影响

表3 抑制miR-320e表达对细胞DU145增殖、凋亡蛋白表达的影响

2.3 miR-320e靶向调控FHIT的表达 生物信息学预测结果显示，FHIT的3’UTR含有与miR-320e互补的核苷酸序列，提示FHIT可能是miR-320e的下游靶基因。双荧光素酶报告实验进行验证，结果表明，与miR-NC和WT- FHIT共转染比较，miR-320e和WT- FHIT共转染明显降低DU145细胞的双荧光素酶相对活性(P<0.05)，而与miR-NC、miR-320e分别与MUT- FHIT共转染后，DU145细胞的双荧光素酶相对活性无明显变化。Western blot检测结果发现，同miR-NC组相比，miR-320e组FHIT蛋白表达量明显减少(P<0.05)，anti-miR-320e组FHIT蛋白表达量比anti-miR-NC组显著增加(P<0.05)。见图2，表4、5。

图2 miR-320e靶向调控FHIT；A FHIT的3’UTR含有miR-320e的互补序列;B miR-320e调控FHIT的表达

表4 双荧光素酶报告实验

表5 miR-320e调控FHIT的表达

2.4 过表达FHIT对细胞DU145增殖、凋亡的影响 将pcDNA3.1-FHIT转染入细胞DU145，发现FHIT蛋白表达量明显高于pcDNA3.1组(P<0.05)，说明过表达FHIT的DU145细胞构建成功。与pcDNA3.1组相比，过表达FHIT明显降低24 h、48 h、72 h的细胞活性(P<0.05)，增加细胞凋亡率(P<0.05)，减少Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量，而提高P21、Bax蛋白水平(P<0.05)。见图3，表6、7。

图3 过表达FHIT对细胞DU145增殖、凋亡蛋白表达的影响

表6 过表达FHIT对细胞DU145增殖、凋亡的影响

表7 过表达FHIT对细胞DU145增殖、凋亡蛋白表达的影响

2.5 抑制FHIT能逆转抑制miR-320e对细胞DU145增殖、凋亡的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-320e明显影响细胞DU145中FHIT、Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达量、细胞活性和细胞凋亡率(P<0.05)。与anti-miR-320e+si-NC组比较，anti-miR-320e与si-FHIT共转染明显减少FHIT、P21、Bax蛋白表达量,而提高Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平，提高24 h、48 h、72 h的细胞活性，并且减少细胞凋亡率，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4，表8、9。

图4 抑制FHIT能逆转抑制miR-320e对细胞DU145增殖、凋亡蛋白表达的影响

表8 抑制FHIT能逆转抑制miR-320e表达对细胞DU145增殖、凋亡的影响

表9 抑制FHIT能逆转抑制miR-320e表达对细胞DU145增殖、凋亡蛋白表达的影响

3 讨论

miRNA是一类高度保守和内源性的基因表达调节因子，它们是长度通常为18～22个核苷酸的单链非编码RNA分子[9]。miRNA与特定mRNA的3，UTR中的靶位点发生互补性结合，使mRNA降解或翻译抑制。miRNA参与许多重要的细胞过程，包括增殖，细胞周期，细胞凋亡，粘附和转移，其中大多数构成癌症的关键标志[10]。近年来，miRNA已被发现在不同类型的人类癌症中异常表达，通过充当癌基因或抑癌基因参与肿瘤进展，包括前列腺癌[11-13]。miR-320e属于miR-320家族，总共包含37个序列，miR-320e位于PRKD2基因内含子-3内的染色体19 q13.32处[14]。与miR-320家族的其他成员相比，miR-320e在人类癌症中的功能作用知之甚少。研究表明，miR-320e在脊索瘤中异常表达，可作为肺癌发展的早期预测因子[15,16]。Perez-Carbonell等[14]学者首次报道了miR-320e在结直肠癌(colorectal cancer，CRC)患者中的临床表达水平和预后相关性，发现miR-320e经常在CRC患者中表达上调，尤其是在晚期肿瘤中，并且miR-320e与肿瘤大小呈正相关趋势(P=0.1047)并伴有淋巴结转移，证实高水平的miR-320e与CRC患者预后不良相关。本研究中，miR-320e在前列腺癌细胞DU145内的表达明显上调(P<0.05)，与前人[6,7]研究结果一致。考察miR-320e失调时的细胞功能，结果发现，抑制miR-320e表达显著降低DU145细胞活性、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达，而提高细胞凋亡率、P21、Bax蛋白水平(P<0.05)，下调miR-320e表现出对前列腺癌的抑制作用。

为了阐明miR-320e的作用机制，miRNA基因靶标的鉴定对于理解miR-320e在前列腺癌中的作用至关重要。本实验利用生物信息学工具TargetScan筛选出miR-320e的预测靶标FHIT。FHIT是一种小的细胞质蛋白，在体外切割三磷酸腺苷(Ap3A)以产生ADP和AMP，并且Ap3A在FHIT缺陷细胞中逐渐积累[17]。FHIT在超过一半的人类癌症中缺失，FHIT的损失可能会改变人恶性肿瘤多种生物学功能，包括凋亡减少，上皮-间质转化(EMT)增加，提高了耐基因毒性剂，改变活性氧的产生和基因组不稳定性，当恢复其表达时，可以诱导细胞凋亡并抑制致瘤性[18-20]。既往研究表明，FHIT参与多种人类恶性肿瘤的肿瘤发生，包括肺癌，乳腺癌，胰腺癌，肾癌等，起着肿瘤抑制作用[21,22]。FHIT在前列腺癌中的表达明显低于癌旁正常组织，FHIT表达与前列腺癌的发生发展有一定的联系[23,24]。Xu等[25]研究了FHIT基因对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的调控作用，发现骨肉瘤细胞系Saos2中FHIT mRNA和蛋白表达明显下调，过表达FHIT明显抑制细胞增殖，而增加细胞凋亡率，这与本实验的结果一致，即FHIT基因抑制前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡，说明FHIT扮演着抑癌因子的角色参与前列腺癌的发生发展。另外，本项研究运用双荧光素酶报告实验证实miR-320e可以靶向调控FHIT的表达，抑制FHIT表达可以逆转抑制miR-320e表达对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响。这些结果表明，靶向FHIT表达可能是miR-320e调节前列腺癌细胞增殖、凋亡的重要途径。

总之，本研究观察到miR-320e在前列腺癌细胞中表达上调，抑制miR-320e表达会抑制前列腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，而miR-320e通过直接靶向调控FHIT的表达在前列腺癌细胞增殖和凋亡中发挥重要作用，证明了miR-320e对前列腺癌发生和进展的影响。因此，miR-320e可能成为前列腺癌患者的新型治疗靶点。