甄国志 麦福劲 林冰 叶宇 庞颖仪 梁洁珩 梁宇玲

【摘要】 目的 探讨精子核蛋白组型转换异常对精子DNA碎片指数（DFI）的影响。方法 400份精液检查标本为研究对象， 按核蛋白组型转换异常率分为<30%组（200例）和≥30%组（200例）。比较两组的精子数及DFI。结果 ≥30%组的大晕环精子数（68.9±11.5）条少于<30%组的（78.6±8.9）条， 无晕环精子数（11.9±8.1）条多于<30%组的（4.3±8.5）条， DFI（23.5±9.6）%高于<30%组的（13.8±8.7）%， 差异均具有统计学意义 （P<0.05） ;两组中晕环精子数、小晕环精子数比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 精子核蛋白组型转换异常对DFI有影响， 可作为评价精子功能的一项有重要意义的参考指标。

【关键词】 精子核蛋白组型转换异常;精子DNA碎片指数;不育症

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.22.013

Discussion on the influence of abnormal sperm nucleoprotein transition on sperm DNA fragment index   ZHEN Guo-zhi， MAI Fu-jin， LIN Bing， et al. Shunde Women and Childrens Hospital of Guangdong Medical University， Foshan 528300， China

【Abstract】 Objective   To discuss the influence of abnormal sperm nucleoprotein transition on sperm DNA fragment index （DFI）. Methods   A total of 400 specimens of semen were taken as the research objects， and were divided into <30% group （200 cases） and ≥30% group （200 cases） according to the abnormal rate of nucleoprotein transition. The sperm count and DFI of the two groups were compared. Results   The number of spermatozoa with large halos （68.9±11.5） pieces of ≥30% group was less than that of <30% group （78.6±

8.9） pieces， number of spermatozoa with no halos （11.9±8.1） pieces was more than that of <30% group （4.3±8.5） pieces， and DFI （23.5±9.6）% was higher than that of <30% group （13.8±8.7）%， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in number of spermatozoa with medium-sized and small-sized halos between the two groups （P>0.05）. Conclusion   Abnormal sperm nucleoprotein transition affects DFI and can be used as an important reference index for evaluating sperm function.

【Key words】 Abnormal sperm nucleoprotein transition; Sperm DNA fragment index; Infertility

男性不育癥是临床常见的一种生殖疾病， 根据世界卫生组织（WHO）的统计， 15% 的育龄夫妇存在不育问题， 其中， 男方因素占40%[1]， DFI是目前评估男性精子质量及功能的重要指标。精子核蛋白组型转换， 是鱼精蛋白与DNA之间的联系导致染色质形成层叠的结构， 使精子染色体高度浓缩、稳定。精子核蛋白组型转换异常， 可使精子DNA稳定性降低， 增大精子DNA的损伤， 在精子受精后精核不能正常聚解， 影响雌雄原核的融合。目前对精子核蛋白组型异常与精子DNA损伤及精子质量之间相关性的报道较少， 本研究通过选取2017年5月～2019年5月本中心精液检查的400份标本进行检测、分析。通过观察精子核蛋白组型转换对DFI的影响， 明确其相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本生殖中心自2017年5月～

2019年5月的400份精液标本， 受检者平均年龄（28±4.1）岁， 禁欲2～7 d， 手淫方法收集精液标本， 按世界卫生组织《人类精液与宫颈粘液相互作用实验室检验手册》（第5版）行精液常规参数检查， 采用CASA系统（北京伟力新世界科技发展有限公司， 型号：WL JY-9000）检测精子。

1. 2 方法

1. 2. 1 精子染色质扩散实验 实验步骤参考 Halo-sperm 试剂盒说明书。步骤简述如下： 新鲜精液行常规检查后用PBS调整至精子密度10×106/ml， 取出30 μl加入溶解的低熔点琼脂糖凝胶30 μl 中， 温度37℃下混匀， 加20 μl 精子凝胶混合液于预处理载玻片上， 盖上22 cm×22 cm 盖玻片， 4℃冰箱水平放置5 min。

移去盖玻片， 放入酸性 DNA 变性液中， 室温孵育7 min。取出玻片浸泡于裂解液中20 min。在蒸馏水中5 min洗去残余裂解液。 玻片依次放入70%、90%和100% 乙醇中各2 min 脱水。晾干后玻片用瑞氏染色液覆盖于样本表面10 min。用自来水冲洗掉染液， 风干。 200倍光镜下观察， 比较精子核和核周围晕环大小， 计算精子DNA 碎片指数。

1. 2. 2 精子核蛋白组型检测（苯胺蓝染色法）

1. 2. 2. 1 实验原理 在精子发生成熟过程中， 与精子核 DNA 结合的碱性蛋白发生组型转换， 富含赖氨酸残基的组蛋白逐渐被富含精氨酸和胱氨酸残基的鱼精蛋白所替代。 在酸性条件下， 苯胺蓝与赖氨酸残基结合生成蓝色化合物， 从而显示富含赖氨酸残基蛋白质的存在。

1. 2. 2. 2 精子核蛋白组型转换检测 精子核蛋白组型转换采用苯胺蓝染色法（试剂盒购自深圳华康生物医学工程有限公司）分析精子核蛋白成熟度， 操作步骤详见试剂盒说明书。正常参考值为核蛋白组型转换异常率<30%。

1. 3 观察指标 比较不同精子核蛋白组型转换异常率间的精子数及DFI。

1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

400份精液标本按核蛋白组型转换异常率分为<30%组（200例）和≥30%组（200例）。≥30%组的大晕环精子数（68.9±11.5）条少于<30%组的（78.6±8.9）条， 无晕环精子数（11.9±8.1）条多于<30%组的（4.3±8.5）条， DFI（23.5±9.6）%高于<30%组的（13.8±8.7）%， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）;两组中晕环精子数、小晕环精子数比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

在精子发生过程中， 生精细胞内DNA含量发生着规律性变化， 富含赖氨酸的组蛋白逐渐被富含精氨酸和胱氨酸的鱼精蛋白所代替。鱼精蛋白与DNA之间的联系导致染色质形成层叠的结构， 使精子染色体高度浓缩、稳定。精子核蛋白组型转换异常， 可使精子DNA稳定性降低， 增大精子DNA的损伤， 在精子受精后精核不能正常聚解。

研究发现， DFI与囊胚形成率有关[2]， 异常的核蛋白可使过量的精源性组蛋白再次被包装入受精卵染色质中， 妨碍卵裂时染色体的行为及胚胎发育过程中基因的表达与调控， 进而影响了雌雄原核的融合， 并且导致胚胎不能正常发育。 Kumar 等[3] 研究指出， DFI>30% 导致胚胎发育受损、胚胎质量严重下降、患不孕症的风险明显增加等不良妊娠结局。这与 Leach等[4]研究结论一致。

目前精子DNA碎片的检测被认为是一个新的评价精子质量和预测生育能力的指标[5]， 但精子核蛋白组型转换与DFI相关性的研究较少， 本研究通过观察精子核蛋白组型转换对DFI的影响， 明确其相关性。目前临床上认为精子核蛋白组型转换异常的正常临界值是30%， 作者的研究发现， ≥30%组的大晕环精子数（68.9±11.5）条少于<30%组的（78.6±8.9）条， 无晕环精子数（11.9±8.1）条多于<30%组的（4.3±8.5）条， DFI（23.5±9.6）%高于<30%组的（13.8±8.7）%， 差异均具有统计学意义 （P<0.05） ;两组中晕环精子数、小晕环精子数比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。 通过分析发现， 精子核DNA完整性与核蛋白成熟度间存在显著正相关， 与先前报道一致 [6]。精子核蛋白组型转换异常可能是男性不育的一个独立性因素 [7] ， 目前精子DNA损伤与核蛋白组型转换的检测方法逐渐趋于成熟和完善， 并在临床上得到了 一定的应用， 因此， 精子核蛋白组型转换可作为评价精子质量和功能的另一项有重要意义的参考指标。并且对胚胎形成及妊娠临床结局是一个有效的预测指标。由于病例数较少， 本研究结论有待于更大量病例数， 采取多中心的数据及更深入的研究以验证。

参考文獻

[1] Jungwirth A， Giwercman A， Tournaye H， et al. European Association of Urology guidelines on Male Infertility： the 2012 update. European Urology， 2012， 62（2）：324-332.

[2] 郑九嘉， 肖仕金， 杨旭， 等. 精子核蛋白组型转换与精液参数、 胚胎发育的相关性分析. 中华泌尿外科杂志 ， 2013， 34（9）：694-698.

[3] Kumar K， Deka D， Singh A， et al. Predictive value of DNA integrity analysis in idiopathic recurrent pregnancy loss following spontaneous conception. Journal of Assisted Reproduction & Genetics， 2012， 29（9）：861-867.

[4] Leach M， Aitken RJ， Sacks G. Sperm DNA fragmentation abnormalities in men from couples with a history of recurrent miscarriage. Australian & New Zealand Journal of Obstetrics & Gynaecology， 2015， 55（4）：379-383.

[5] World health organization. WHO laboretory  mannal  for the Exanination and processing of human semen （nonserial publications）. Journal of Andrology， 2010， 30（2）：9.

[6] 陈康， 周宇林， 余波澜， 等.精子核蛋白组型异常及DNA损伤与 精子活动力的相关性研究.中华临床医师杂志（电子版）， 2013， 7（2）：575-578.

[7] 刘居理， 罗明， 卢雪芳， 等. 男性不育患者精子核蛋白组型转换与精子密度及活力分析. 检验医学与临床， 2009， 6（13）：1061-1062.

[收稿日期：2020-04-02]