王 磊 赵 强 陈晓琦 张传雷 王新亭 陈欣菊△

1.河南中医药大学第一临床医学院 （河南 郑州，450046） 2.河南中医药大学第一附属医院

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率居全国恶性肿瘤第4位，死亡率则高居全国恶性肿瘤第2位［1］。遗传因素、慢性病毒感染、非酒精性脂肪性肝病、吸烟以及饮酒等均可导致肝癌的发生和进展，但诱发肝癌的确切分子机制仍然未知［2］。目前，肝癌的局部治疗包括肝切除术、肝移植术、局部消融治疗、肝动脉介入治疗和放射性核素免疫治疗等，然而肝癌是一种高度耐药且难以治疗的癌症，现有的治疗手段不能满足医疗需求，迫切需要发现新的分子生物标志物和治疗靶点，以制定更加精确的医疗策略［3］。成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）属于受体酪氨酸激酶（RTKs）家族，过表达的FGFR4通过激活多个下游信号通路，调控细胞的生存、增殖、侵袭和迁移等，诱发肝癌［4］。靶向FGFR4信号通路成为一种治疗肝癌的新策略。近年来，中医药在肝癌的手术和放疗后的辅助治疗中凸显了独特的优势［5］。扶正消瘤颗粒是河南中医药大学第一附属医院肝病诊疗中心协定处方，前期研究发现，扶正消瘤颗粒含药血清可诱导肝癌HepG2细胞凋亡［6］，但其体内的抗癌药效研究及相关机制尚不明确。因此，本研究通过建立HepG2裸鼠肝癌移植瘤模型，探讨扶正消瘤颗粒在体内抑瘤活性，以及对FGFR4、MMP2、Cyclin D1和Bcl-xL表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄SPF级雌性BALB／c裸鼠10只，体质量16～18g，购自北京维通利华实验动物公司，饲养于河南中医药研究院动物房，标准饲料饲喂，每日光照和黑暗交替各12小时。

1.2 细胞株 人肝癌HepG2细胞株由郑州大学医学科学院提供。

1.3 药品及试剂 扶正消瘤颗粒（FZXLG，含黄芪、党参、菝葜、鳖甲、牡蛎等药味）购自江阴天江药业有限公司；谷丙转氨酶（ALT，Cat.No.C009-1）、谷草转氨酶（AST，Cat.No.C010-1）、白蛋白（Alb，Cat.No.A028-2-1）以及甲胎蛋白（AFP，Cat.No.E014-1-1）测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠多克隆抗体FGFR4（Lot.No.E-AB-19391）、MMP2（Lot.No.GB11130）、Cyclin D1（Lot.No.BM1583）以及Bcl-xL（Lot.No.GTX100064）均购自Genetex公司；PBS缓冲液（Lot.No.G0002）、BSA（Lot.No.G5001）、苏木素染液（Lot.No.G1004）、中性树胶（Lot.No.G1403）、二 抗HRP标 记 山 羊 抗 兔IgG（Lot.No.GB23303）、DAB显色剂（Lot.No.G1211）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；高糖DMEM培养基（Lot.No.0033617）、胰酶（Lot.No.0010218）购自Biological Industries公司；胎牛血清（Lot.No.42Q7380K）、RIPA裂解液（Lot.No.N653）分别购自Gibco公司和VWR公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 HepG2细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清和100 U／mL双抗的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，每2天更换1次培养基。

1.4.2 动物造模及分组干预 HepG2细胞生长至培养瓶90%时进行传代，传代3次后，用PBS重悬至1×107／mL，取0.2 mL细胞悬液接种于裸鼠右腋皮下，接种48 h后可触及肿瘤结节。接种后2d，依据简单随机抽样法，将动物随机分为模型组和治疗组，每组5只。按照人与小鼠体表面积换算，治疗组裸鼠所需扶正消瘤颗粒量为29 g／kg，用生理盐水配置成所需浓度，0.2 mL／只灌胃，模型组裸鼠给予0.2 mL／只生理盐水灌胃，均2次／d，连续21 d。

1.4.3 组织样品的处理 接种后22 d，所有动物称取重量后，按剂量2.5 m l／kg腹腔注射水合氯醛麻醉，而后开腹，下腔静脉采血，置于2 ml EP管中，2 000 r／min离心15 min，留取血清用作生化检测；剥离肿瘤组织，分析天平称重后切取0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的一块组织置于预先留有编号标签的包埋框中，将装有肿瘤组织的包埋框置于10%福尔马林溶液中固定。其余肿瘤组织装入2 ml EP管中置于-70℃超低温冰箱中保存备用。根据肿瘤重量计算抑瘤率，抑瘤率＝［1-（治疗组平均瘤重／模型组平均瘤重）］×100%。

1.4.4 生化指标检测 动物血清中ALT、AST、Alb以及AFP等的检测方法均参照试剂盒说明书。

1.4.5 免疫组化检测 石蜡切片脱蜡至水，将组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（pH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8 min至沸，停火8min保温再转中低火7 min，自然冷却后将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min，阻断内源性过氧化物酶；在组化圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min；轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按1∶500配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜；玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；切片稍甩干后在圈内滴加二抗HRP覆盖组织，室温孵育50 min；玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min，切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液；苏木素复染3 min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，返蓝；脱水封片，显微镜镜检，Pannoramic viewer软件图像采集。

1.4.6 蛋白质免疫印迹检测 将两组裸鼠肿瘤组织切成小块，加入RIPA裂解液，4℃下12 000 r／min离心30 min取上清液，BCA法测定蛋白浓度。两组样品蛋白上样量为20μg，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜；用含5%脱脂牛奶的封闭液室温下封闭1 h，加一抗4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10 min；加二抗，室温下孵育2 h，TBST洗膜后显影，Quantity One软件分析条带灰度值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0进行数据统计，计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤裸鼠体重、瘤重、瘤体比以及抑瘤率情况 见表1、插页图1。所有裸鼠均造模成功。随着移植瘤体积不断增大，模型组裸鼠逐渐出现活动减少，进食水减少，消瘦，呈恶病质状态；治疗组裸鼠精神状态明显好于模型组，活动基本正常。

表1 荷瘤裸鼠体重、瘤重、瘤体比及抑瘤率比较 （±s）

表1 荷瘤裸鼠体重、瘤重、瘤体比及抑瘤率比较 （±s）

与模型组比较，*P＜0.05

组别 例数 体重（g） 瘤重（g） 瘤体比（%）抑瘤率（%）5 19.28±0.57 0.94±0.06 4.89±0.46 0治疗组 5 20.16±0.24* 0.65±0.10* 3.23±0.53*模型组30.85

2.2 荷瘤裸鼠肝功能检测结果 见表2。

表2 荷瘤裸鼠血清生化检测结果比较 （±s）

表2 荷瘤裸鼠血清生化检测结果比较 （±s）

与模型组比较，*P＜0.05

组别 例数 ALT（U／L） AST（U／L） Alb（g／L） AFP（U／L）模型组5 20.76±3.71 20.39±4.93 10.19±0.57 31.91±5.12治疗组5 20.59±2.98 20.68±3.76 9.98±0.63 23.45±4.78*

2.3 荷瘤裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1及Bcl-xL表达情况 免疫组化结果显示，治疗组裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表达均低于模型组（P＜0.05）。见插页图2。蛋白质印迹结果显示，与模型组比较，治疗组裸鼠FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表达显著降低（P＜0.01）。见图3。

3 讨论

中医学认为，正气亏虚，瘀毒痰湿互结是肝癌发生的基本病机，正气虚、毒邪盛是其复发、转移的关键。扶正消瘤颗粒由黄芪、党参、菝葜、鳖甲、牡蛎等组成，具有益气解毒、活血化瘀、化痰祛湿的功效，且以扶正为主，兼以祛邪，攻补兼施，祛邪而不伤正，主要用于各期肝癌，临床疗效可靠［6］。

本研究显示，扶正消瘤颗粒具有明显的抗肿瘤活性（P＜0.05），可以抑制肝癌移植瘤的生长和增殖。FGFR4是一种酪氨酸激酶受体，可选择性地结合成纤维细胞生长因子19（FGF19），通过下游MAPK和AKT信号通路介导细胞效应，诱发肝癌［7］。基质金属蛋白酶家族（MMPs）属于锌依赖性内肽酶，在细胞侵袭和迁移过程中参与细胞外基质（ECM）的降解［8］，MMP-2是其一个重要成员，能降解多种细胞外基质，如明胶、层黏连蛋白以及I型胶原等，在肿瘤细胞透过细胞外基底膜迁移以及其他过程中发挥重要作用，在肝癌组织中异常高表达，与肝癌的侵袭和转移密切相关［9］。细胞周期蛋白调控细胞周期的各个时相，其中参与细胞周期调控的主要因子是Cyclin。调控G1期的关键蛋白之一是Cyclin D1，在细胞周期中，G1期的启动是细胞周期的关键，过度表达Cyclin D1蛋白可使细胞G1期缩短，导致肿瘤细胞过度增殖。研究表明，Cyclin D1基因表达下调能抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡［10］。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，其过表达可以抑制肝癌细胞凋亡［11］。本研究显示，扶正消瘤颗粒可以下调瘤体组织中FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表达，具有抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的潜力，进而抑制肝癌进展。

综上所述，扶正消瘤颗粒具有抑制HepG2肝癌裸鼠移植瘤生长的作用，其抗肿瘤机制可能与下调FGFR4、MMP2、Cyclin D1以及Bcl-xL的表达有关，为探索治疗肝癌的新方法提供了思路与依据。但中药抗肿瘤作用具有多环节、多靶点的特点，扶正消瘤颗粒在体内的抗肿瘤作用可能还有其他作用机制，尚需进一步研究。