仲志婷 苗青青 蒋柱燕 张梦洁 唐隽

1安徽医科大学附属解放军联勤保障部队第901 医院皮肤科，合肥230031；2陆军军医大学病理生理与高原病理学教研室，重庆400038

环状RNA（circRNA）是一种非编码RNA分子，没有5′端帽和3′端poly（A）尾部，通过共价键形成环状结构［1］。circRNA 可作为miRNA 的“海绵”来调节下游靶基因的表达［2］，调节亲本基因转录［3］，与RNA 结合蛋白相互作用［4］，以及翻译蛋白质［5］。我们前期研究［6］采用高通量RNA测序，分析了3例系统性红斑狼疮（SLE）患者与3例健康对照外周血单个核细胞（PBMC）中circRNA 的差异表达，通过生物信息学分析筛选出4 个候选circRNA，并经实时荧光定量PCR（qRT-PCR）证实circ蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型（PTPN22）在SLE患者PBMC中表达降低，且与SLE 疾病活动指数（SLEDAI）评分呈负相关。本研究探讨circ-PTPN22的翻译能力及其翻译蛋白对Jurkat细胞活化和凋亡的作用。

对象与方法

一、研究对象

2019 年5 月10 日至9 月30 日分别于西南医院中西医结合风湿免疫科和体检中心收集6 例SLE女性患者（SLEDAI评分10 ～14分）和9例健康女性对照全血样本，年龄25 ～50 岁。本研究经解放军第105 医院（现更名为解放军联勤保障部队第901医院）伦理委员会批准（ 伦理编号105LL20150308），所有受试者均签署知情同意书。

二、细胞来源及主要试剂

Jurkat 细胞系来源于美国ATCC 细胞库。RiboTM荧光原位杂交试剂盒（广州锐博生物技术有限公司），circ-PTPN22-cy3探针和18S-cy3对照探针均由广州锐博生物技术有限公司设计合成。内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单抗（美国Bioss公司），山羊抗兔抗体、山羊抗小鼠抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），circ-PTPN22-FLAG 和circ-PTPN22-NC-FLAG 重组慢病毒由上海生博生物医药科技有限公司构建，circ-PTPN22-shRNAFLAG和circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG慢病毒由上海泰儿图生物科技有限公司合成。Dynabeads™Human T-Activator CD3/CD28 用于活化和扩增人T细胞（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。藻红蛋白标记的抗人白细胞介素（IL）-2 抗体、7-AAD Viability Staining Solution（美国Biolegend 公司），小鼠抗FLAG®M2 单抗（美国Sigma-Aldrich 公司），ELISA 试剂盒（英国abcam 公司），RIPA 裂解液、一抗稀释液、二抗稀释液、Quick-Blocker 封闭液、2×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司），ExpressPlus™PAGE Gels 4%～20%（南京金斯瑞生物科技有限公司），EasySep™人T细胞分离试剂盒、EasySep™人B 细胞分离试剂盒、EasySep™人NK 细胞分离试剂盒（加拿大STEMCELL Technologies 公司），eBioscience™Foxp3 转录因子染色液（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

三、方法

1.PBMC分离：全血与磷酸盐缓冲液（PBS）及样本密度分离液体积比为1∶1∶1，805×g离心20 min，取白膜层，加PBS 10 ml，201×g 离心5 min 后弃上清液，得到PBMC。加入二甲基亚砜和胎牛血清（体积比1∶9），-80 ℃过夜，第2天转入液氮中保存。

2.荧光原位杂交法观察circ-PTPN22在健康人PBMC中的表达定位：针对circ-PTPN22剪接位点设计一段带有cy3 标记的探针circ-PTPN22-cy3，对照组探针为18S-cy3。从3 例健康人5 ml 全血样本中分离PBMC。50 μl PBS 重悬PBMC，取2 张多聚赖氨酸处理过的载玻片，分别标记为circ-PTPN22-cy3组和18S-cy3组。各取10 μl细胞悬液到载玻片，静置待干。然后依次用4%多聚甲醛室温固定10 min，预冷通透液4 ℃5 min，200 μl预杂交液37 ℃30 min，避光下将circ-PTPN22-cy3 和18S-cy3 两种探针各1.5 μl 分别加入100 μl 预热的杂交液混匀，弃去载玻片上的预杂交液，将探针混合物滴到含有细胞的载玻片上，放入湿盒，37 ℃避光过夜。第2天，42 ℃避光条件下，分别用杂交洗液Ⅰ、杂交洗液Ⅱ、杂交洗液Ⅲ洗涤，然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色10 min，最后荧光显微镜下拍照。

3. Jurkat 细胞培养与慢病毒转染：用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素）、在37 ℃5% CO2恒温孵箱中培养Jurkat 细胞，第2 天换液。为验证预测的circ-PTPN22 蛋白编码功能，分别将circ-PTPN22-FLAG、circ-PTPN22-NCFLAG、circ-PTPN22-FLAG + circ-PTPN22-shRNAFLAG、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 重组慢病毒［病毒载体含绿色荧光蛋白（GFP）基因］转入Jurkat细胞（circ-PTPN22-FLAG 组、circ-PTPN22-NCFLAG 组、circ-PTPN22-shRNA-FLAG 组、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 组），同时设置Jurkat 细胞对照组（仅正常培养）。采用12 孔板，每孔5 ×105个细胞，每组各3 个复孔，重组慢病毒感染复数（MOI）均为50。培养48 h后收集细胞，期间可根据细胞生长状态添加完全培养基和传代。

4.circ-PTPN22pro 抗体制备与鉴定：委托上海烈冰生物医药科技有限公司测定circ-PTPN22核酸序列。根据测序结果，委托杭州华安生物技术有限公司［动物试验许可证号：SYXK（浙）2017-0009］针对circ-PTPN22 剪接位点处的特异性氨基酸序列GNSNYLPVSLQELARP 合成肽段并制备多克隆抗体，然后使用亲和层析柱纯化抗体。采用常规多克隆抗体制备方法，选用2 只体重2.5 kg 左右的健康新西兰雄性白兔（编号为4137、4138），采用多点皮下注射各免疫3次，首次免疫后第14天进行2次免疫，第2 与第3 次免疫间隔7 d，第3 次免疫后第7 天，于兔耳中动脉采少量全血提取血清进行间接ELISA检测。检测合格后，进行加强免疫，7 d后可采集全血。采用转染了circ-PTPN22 的Jurkat 细胞鉴定所制备的多克隆抗体，将转染的Jurkat细胞裂解上清液经SDS-PAGE电泳后，用所制备兔抗血清作为一抗进行Western印迹法分析。

5. 间接ELISA 法检测制备的兔抗circ-PTPN22pro 抗体效价：按ELISA 试剂盒说明书依次进行包被抗原（合成的目的肽段）、1×TBST缓冲液洗涤、TBST配制的1%牛血清白蛋白（BSA）封闭，加入稀释的待检样品（即制备的抗体）37 ℃反应1 h、洗涤2 次。设置阳性对照孔（阳性血清）与阴性对照孔（BSA）。然后加辣根过氧化物酶标记二抗羊抗兔抗体孵育，1×TBST 缓冲液洗3次。加底物显色，2 mol/L硫酸终止反应后，于酶标仪450 nm波长处读取吸光度。各实验孔与BSA阴性对照孔A450比值＞2.1时，为抗体滴度判定终点。

6.磁珠分选人PBMC：根据EasySep™Human T Cell Isolation Kit，分别用250 μl EasySep™缓冲液重悬3 例健康对照和3 例SLE 患者各15 ml 全血提取的PBMC，并用细胞计数板计数，每管加入50 μl/ml Isolation Cocktail，混匀后室温等待5 min，振荡30 s后每管加入40 μl/ml RapidSpheres™，用EasySep™缓冲液补齐至2.5 ml，混匀后放入配套的磁铁中，室温静置3 min，垂直将细胞悬液倒入另一新流式管中，将新管放入磁铁中，静置3 min，同样的方法倒出，得到分选后的T 细胞。参照上述方法分选B、NK细胞。用相应的抗体检测细胞纯度。

7. Western 印迹法检测细胞中circ-PTPN22pro蛋白表达：按照“3.Jurkat 细胞培养与慢病毒转染”中方法转染48 h 后，收集各组Jurkat 细胞，RIPA 裂解液提取总蛋白。加入2 × SDS 蛋白上样缓冲液（1∶1），煮沸变性。每孔上样量30 μg，160 V恒压电泳35 min，25 V 25 mA 6 min 半干转到聚偏二氟乙烯膜上，室温封闭30 min，分别加一抗小鼠抗FLAG标签抗体（1∶1 000）、兔抗人GAPDH抗体（1∶4 000）4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜5 次，每次6 min；加二抗山羊抗兔、山羊抗鼠抗体（均为1∶4 000）室温摇晃孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，然后用Bio-Rad 成像仪曝光拍照。使用Image Lab 6.0 软件计算每组circ-PTPN22pro 条带与GAPDH 条带的调整灰度值之比。此外，采用上述方法检测3例健康对照和3 例SLE 患者PBMC 及另3 例健康对照和3 例SLE 患者T、B、NK 细胞亚群中circ-PTPN22pro 表达，一抗为制备的兔抗人circ-PTPN22pro 抗体（1∶500），二抗为山羊抗兔抗体。

8. 流式细胞仪检测circ-PTPN22 对细胞活化和凋亡的影响：按照“3.Jurkat 细胞培养与慢病毒转染”中方法将circ -PTPN22、circ-PTPN22-NC、circ-PTPN22 - shRNA、circ - PTPN22 -shRNA-NC 慢病毒分别转染Jurkat 细胞（circ-PTPN22 组、circ-PTPN22-NC 组、circ-PTPN22-shRNA 组、circ-PTPN22-shRNANC 组）24、48 和72 h 后，每孔加Dynabeads ™Human T-Activator CD3/CD28 4 μl，恒温孵育6 h 后收集转染的Jurkat 细胞。分别用200 μl PBS重悬，各组取1×106细胞，加入200 μl穿孔液室温20 min，500 μl 通透缓冲液453 × g 离心8 min，洗涤2次。重悬后每管加入1 μl藻红蛋白抗人IL-2抗体，室温避光20 min后洗涤2次，用含2%胎牛血清的PBS重悬细胞，流式细胞仪检测IL-2阳性细胞比例，以检测细胞活化状态。此外，收集各组转染48、72、96 h后的Jurkat 细胞，检测前10 min每管加7-AAD Viability Staining Solution 2 μl，流式细胞仪检测细胞凋亡率，即7-AAD阳性细胞比例。

9.统计学方法：应用SPSS25.0 软件，采用两因素重复测量方差分析分别分析过表达和干扰circ-PTPN22 不同时间对Jurkat 细胞活化及凋亡的影响。采用GraphPad Prism8 软件，两组计量资料的比较采用两独立样本t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、circ-PTPN22在健康人PBMC细胞中的定位

荧光原位杂交法显示，circ-PTPN22 和阳性对照18S 均主要表达在健康人PBMC 细胞质内，见图1。

二、circ-PTPN22的翻译能力预测

测序结果显示，circ-PTPN22基因全长1 429 bp，含9 个外显子。为预测该基因是否具有翻译蛋白的能力，通过circRNADb 网站（http：//reprod.njmu.edu.cn/circrnadb）进行比对，预测出circ-PTPN22 第718 ～838位碱基共121 bp的内部核糖体进入位点（IRES）序列（图2A 绿色序列）。因为测得的circ-PTPN22全长为1 429 bp，所以排除1 399 ～1 507 bp的潜在IRES 序列。翻译能力预测见图2B，ORF 框从910 bp 跨剪接位点至50 bp 处，潜在翻译的蛋白质序列共189 个氨基酸，将其命名为circ-PTPN22pro；GNSNYLPVSLQELARP 序列为该编码蛋白不同于全长PTPN22 蛋白的特异氨基酸序列（图2B）。

图1 荧光原位杂交法检测circ-PTPN22在健康人外周血单个核细胞中的定位 图像融合后可见circ-PTPN22与18S均主要表达在细胞质中

图2 circ-PTPN22蛋白编码预测 2A：circ-PTPN22基因的预测编码序列；绿色部分代表IRES序列，灰色部分代表ORF框，跨剪接位点翻译，红色标记ATG、TGA分别为翻译的起始密码子和终止密码子；2B：circ-PTPN22pro的预测氨基酸序列，序列的红色部分是不同于全长PTPN-22蛋白的独特氨基酸序列

三、circ-PTPN22pro多克隆抗体制备及鉴定

ELISA 结果显示，3 次免疫后，2 只兔血清效价均达到1∶256 000。Western 印迹法鉴定circ-PTPN22pro 多克隆抗体显示，4 137 号兔血清的特异性较好，相对分子质量为20 000左右的目的条带显示清晰，但未检测到全长型PTPN22pro（相对分子质量98 000）（图3），提示circ-PTPN22pro 多克隆抗体制备成功，特异性针对circ-PTPN22pro。因此，在后续临床相关实验中使用4 137 号兔血清进行实验。

四、circ-PTPN22编码功能验证

转染重组慢病毒后48 h，circ-PTPN22-FLAG组、circ-PTPN22-NC-FLAG组、circ-PTPN22-shRNAFLAG 组、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 组细胞均有绿色荧光表达（图4A），说明重组慢病毒转染成功。Western 印迹结果显示，circ-PTPN22-FLAG 组circ-PTPN22pro 表达明显高于circ-PTPN22-NCFLAG 组和细胞对照组，且相对分子质量约为20 000；circ-PTPN22-NC-FLAG 组及细胞对照组有少量表达，提示Jurkat 细胞内源性表达circ-PTPN22pro（图4B）。与circ-PTPN22-FLAG组相比，circ-PTPN22-shRNA-FLAG 组circ-PTPN22pro 表 达明显降低，见图4C。

五、circ-PTPN22对细胞活化和凋亡的影响

转染24、48、72 h后，流式细胞仪检测显示，circ-PTPN22 组IL-2 表达（22.20% ± 8.92%，31.10% ±5.88%，53.20% ± 10.25%）均低于circ-PTPN22-NC组（30.90% ± 11.00%，51.23% ± 10.70%，69.67% ±9.00%）；circ-PTPN22-shRNA组IL-2表达（35.57%±8.79%，78.10%± 10.08%，88.63%± 3.89%）均高于circ-PTPN22-shRNA-NC 组（26.73% ± 4.92%，41.03% ± 10.45%，41.33% ± 4.96%），见图5A、5B。两因素重复测量方差分析显示，circ-PTPN22 组与circ-PTPN22-NC 组间差异有统计学意义（F =284.881，P=0.003）；circ-PTPN22-shRNA 组与circ-PTPN22-shRNA-NC 组间差异亦有统计学意义（F=293.818，P=0.003）。

图5 流式细胞仪检测circ-PTPN22 对Jurkat 细胞活化和凋亡的影响 转染24、48 和72 h 后，circ-PTPN22 组IL-2 表达均明显低于circ-PTPN22-NC组（5A），circ-PTPN22-shRNA组IL-2表达均明显高于circ-PTPN22-shRNA-NC组（5B）；转染48、72、96 h后，circ-PTPN22组细胞凋亡率均高于circ-PTPN22-NC组（5C），circ-PTPN22-shRNA组细胞凋亡率亦明显高于circ-PTPN22-shRNA-NC组（5D）

转染48、72、96 h后，流式细胞仪检测显示，circ-PTPN22 组细胞凋亡率（7.08% ± 1.33%，19.17% ±3.29%，30.03% ± 9.24%）高于circ-PTPN22-NC 组（5.01% ± 1.52% ，5.63% ± 0.81% ，14.22% ±3.96%），且circ-PTPN22-shRNA 组细胞凋亡率（24.63% ± 10.58%，59.17% ± 15.64%，84.87% ±2.91%）亦明显高于circ-PTPN22-shRNA-NC 组（6.59% ± 3.37% ，5.33% ± 1.65% ，15.42% ±7.31%），见图5C、5D。两因素重复测量方差分析显示，circ-PTPN22 组与circ-PTPN22-NC 组间差异有统计学意义（F = 81.287，P = 0.012）；circ-PTPN22-shRNA 组与circ-PTPN22-shRNA-NC 组间差异亦有统计学意义（F=111.813，P=0.009）。

六、circ-PTPN22pro 在 健 康 对 照 和SLE 患 者PBMC中的差异表达

Western 印迹结果显示，SLE 组PBMC 中circ-PTPN22pro 表达低于健康对照组，几乎不表达（图6A）。进一步用磁珠分选后结果显示，SLE 组T、B细胞中circ-PTPN22pro 表达（0.398±0.147、0.072±0.027）均显著低于健康对照组（1.090 ± 0.365、0.512 ± 0.157；t 值分别为3.047、4.806；P 值分别为0.038、0.009），SLE组与健康对照组NK细胞中circ-PTPN22pro 表达差异无统计学意义（0.139 ± 0.147比0.088±0.032；t=0.582，P=0.592），见图6B。

讨 论

一些有IRES 序列及ORF 框的circRNA 具有编码蛋白能力［7］。我们在circRNADb数据库比对circ-PTPN22序列，发现circ-PTPN22有跨剪接位点翻译的ORF 框，并在Jurkat 细胞中检测出circ -PTPN22pro表达。通过荧光原位杂交法，我们检测出circ-PTPN22 主要在细胞质中表达，提示circ-PTPN22 可能主要在细胞质中发挥作用。与circ-PTPN22-NC 组相比，过表达circ-PTPN22 可抑制Jurkat 细胞活化，促进Jurkat 细胞凋亡；而干扰了circ-PTPN22 的表达可促进细胞活化，同时促进细胞凋亡。推测细胞凋亡的原因可能是干扰circ-PTPN22 表达后，circ-PTPN22pro 蛋白表达降低，导致细胞过度活化诱导了细胞凋亡［8］。

图6 系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMC）及其T、B、NK 细胞亚群中circ-PTPN22 蛋白表达 6A：PBMC 中circ-PTPN22pro表达 3例SLE患者均明显低于3例健康对照；6B：T、B细胞中circ-PTPN22pro表达 SLE患者均明显低于健康对照，但两组NK细胞中circ-PTPN22pro表达无明显差异

通过制备兔抗circ-PTPN22pro 特异性多克隆抗体，我们检测了SLE患者和健康对照PBMC及其T、B、NK细胞亚群中circ-PTPN22pro的表达。结果显示，SLE 患者组PBMC 中circ-PTPN22pro 表达明显低于健康对照组，甚至不表达；SLE 患者组T、B细胞亚群中circ-PTPN22pro 表达亦显著低于健康对照组，而两组NK 细胞中circ-PTPN22pro 表达无明显差异。提示circ-PTPN22 和circ-PTPN22pro 蛋白可能对SLE的发生发展有一定作用，是影响SLE疾病的重要靶标分子之一。

PTPN22是一种淋巴特异性磷酸酶（Lyp），可抑制T细胞活化；当PTPN22第620位精氨酸（R）突变成色氨酸（W）时，PTPN22活性增强，可抑制T 细胞受体（TCR）的信号传导，从而促进自身免疫的发展［9］。PTPN22突变体PTPN22-R620W（LypW）在多种自身免疫疾病中起重要作用，比如SLE［10］、类风湿关节炎［11］等。SLE患者血清干扰素（IFN）-α水平升高，且IFN 驱动的下游基因表达增高［12］。然而，携带PTPN22 突变体LypW 的SLE 患者与非携带SLE患者血浆IFN-α水平无明显差异，但携带LypW的患者产生Toll 样受体（TLR）7 诱导的Ⅰ型IFN 能力降低，提示携带LypW 的SLE 患者可能存在Toll样受体或浆细胞样树突细胞依赖的宿主防御或抗炎功能缺陷［13］。PTPN22 是circ-PTPN22 的亲本基因，推测circ-PTPN22 可能与其亲本基因之间有相互作用或者具有类似PTPN22的作用。在后续研究中，我们将对circ-PTPN22与PTPN22相互作用进行深入研究，探索circ-PTPN22的作用机制，研究circ-PTPN22 或circ-PTPN22pro 蛋白在SLE 中的作用及机制。

志谢陆军军医大学免疫学教研室杨玓老师和田志强老师；西南医院中西医结合风湿免疫科和体检中心

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