李钻芳, 李 乐, 杨敏光, 梁胜祥, 黄云梅, 林如辉

脑缺血是常见的临床疾病，严重威胁人类健康。随着基础研究的不断深入，出现许多脑缺血动物模型。其中大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型使用最为广泛[1-3]，而光化学法诱导脑缺血模型则与临床血栓形成机制更相似[4-5]。本研究制作大鼠MCAO与光化学诱导脑缺血两种模型，结合小动物磁共振成像技术，比较两种大鼠缺血模型缺血区影像学及超微结构的差异，为脑梗死溶栓治疗研究提供动物模型选择的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 雄性SD清洁级大鼠36只[上海斯莱克实验动物有限责任公司]，鼠龄2.5月龄，于福建中医药大学实验动物中心饲养至(250±30)g [许可证号：SYXK(闽)2005-004]。所有大鼠饲养在独立通气系统实验室，具有独立换气系统，维持24 ℃恒温，光照周期为12 h开/12 h关，自由进食、取水。

1.1.2试剂 戊二醛(中镜科仪广州分公司)，四氧化锇(中镜科仪广州分公司)，异氟烷、MCAO线栓(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，玫瑰红(北京索莱宝科技有限公司)。

1.1.3实验仪器 超导型核磁共振成像系统(7.0 T，德国布鲁克公司)对大鼠头颅进行T2加权成像(T2WI)、磁敏感加权成像(SWI)扫描，其中磁共振仪器的线圈为大鼠专用头部线圈。透射电镜(H-7650，日本Hitach 公司)，超薄切片机(UC-6，德国 Leica 公司)。脑立体定位仪(68001，深圳瑞沃德生命科技有限公司)，颅骨钻(78001，深圳瑞沃德生命科技有限公司)，532nm激光器(HW532AD300-100F，深圳市红外线激光科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1MCAO大鼠模型(MCAO模型组)的建立 术前18只大鼠均禁食12 h。在室温条件下，参照文献[1]方法行左侧MCAO手术。腹腔注射水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，颈部皮肤消毒剃毛，正中切开颈部皮肤及皮下组织，钝性分离左侧颈总动脉(arteria carotis communis，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)及颈内动脉(internal carotid artery，ICA)。结扎CCA近心端及ECA，用微动脉夹夹闭远端ICA。在CCA上近分叉处约5 mm处剪一“V”型小口，将线栓经CCA插入ICA，直至有少许阻力感，即阻断大脑中动脉入口处(从ECA与ICA分叉处起计算，约插入18～22 mm)，结扎ICA，伤口常规缝合。1.5 h后缓慢退出线栓，使血流再灌注，造模完成[6]。

1.2.2光化学诱导大鼠脑缺血模型(光化学诱导模型组)的建立 术前18只大鼠均禁食12 h。腹腔注射水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，呈俯卧状态，头部固定在脑立体定位仪上，环境温度保持于(25.0±0.5)℃，手术野的温度控制于(37.0±0.5)℃。在眼外眦和外耳道连线中点垂直切开皮肤约1.2 cm，暴露颞骨，使用直径2.1 mm的圆形颅钻于颧骨与颞骨鳞部接合、靠右1 mm处开直径为0.3 cm的颅窗，打磨过程中用生理盐水反复冲洗创面，消除机械热及残骨渣[4]。90 s 内尾静脉缓慢注射玫瑰红(20 mg/kg)，10 min后将波长532 nm 激光(30 mW)调节为覆盖手术区的圆形投射影，照射20 min，常规缝合伤口即完成光化学脑梗死模型制作[4]。

1.2.3MRI检测大鼠脑影像结构 各组大鼠在造模24 h后行T2WI及SWI扫描。大鼠俯卧位，配合呼吸麻醉系统，扫描成像时全程通以适量比例的异氟烷与氧气，并实时监控大鼠的呼吸状态。采用水温循环系统保证大鼠的生理温度。

结构T2WI采用弛豫增强快速采集(RARE)序列，重复时间TR 2 600 m，回波时间TE 33 ms，层厚0.8 mm，层间距0 mm，层数21，视野(FOV) 35 mm×35 mm，矩阵 256×256，反转角(FA)180°，重复次数分别为4次，扫描时间5 min 23 s。微血管成像采用SWI-FLASH(磁敏感快速小角度激发成像)序列，TR 600 ms，TE 20 ms，层厚0.6 mm，层数18，FA 30°，FOV 30 mm×30 mm，矩阵384×384，扫描时间14 min 46 s。

1.2.4透射电镜观察脑超微结构 所有大鼠经磁共振检测后腹腔注射3 mL/kg水合氯醛进行麻醉，打开头盖骨后迅速原位固定脑组织，于皮质缺血区边缘及对侧正常组织各取3块约1 mm3的小块放入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定48 h(4 ℃)，PBS充分漂洗后，经1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定2 h，再经PBS漂洗；酒精-丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋。半薄切片定位后以90 nm超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，在透射电子显微镜80 kV下观察、摄片。

2 结 果

2.1影像学观察结果 T2WI图像上可见MCAO模型组大鼠皮质缺血区范围较大，波及纹状体，部分大鼠整个半脑缺血；光化学诱导模型组大鼠缺血区范围较小，稳定在激光照射区附近，大脑其他区域未受影响。缺血体积统计显示，MCAO模型组梗死区体积为(32.53±21.36)%，而光化学诱导模型组梗死区体积仅为(3.32±2.13)%，两组比较，差别有统计学意义(P<0.05)。

SWI成像显示，MCAO模型组大鼠皮质缺血区微血管较小，仅个别大血管畅通，而光化学诱导模型组大鼠缺血区附近存在大量微小血管，提示其血脑屏障存在恢复状态。

2.2超微结构观察结果 各模型组大鼠对侧正常区神经细胞呈椭圆形，细胞膜完整，表面有较丰富细胞突起；细胞核呈圆形，染色质分布均匀，无明显边聚或肿胀现象，核仁明显；细胞内有丰富的粗面内质网，线粒体较多，糖元丰富，血管内皮细胞完整。MCAO模型组缺血区与正常结构相比，神经细胞变形，体积缩小，表面突起减少，边界不清；细胞核体积缩小，电子密度增加，染色质分布不均，部分呈边聚现象；线粒体体积缩小，偶见溶酶体，粗面内质网体积缩小，脱颗粒现象明显；血管变形明显，偶见内皮细胞，血管周围肿胀。光化学诱导模型组的造模缺血区神经细胞边界不清，细胞膜部分破损，细胞核呈椭圆形，染色质分布不均，电子密度低，呈轻微肿胀，线粒体结构破损、嵴呈断裂现象，粗面内质网结构肿胀，脱颗粒现象明显；部分血管内皮细胞肿胀，血管周围水肿明显，部分组织溶解。

3 讨 论

脑缺血动物模型对于研究人类脑缺血损伤的病理生理机制及评估其干预手段具有重要的参考价值。MCAO模型为经典的脑缺血动物模型，应用最广泛，因其不需要开颅、可准确控制缺血和再灌注时间等特点，对研究药物疗效以及再灌注损害和治疗时间窗等方面较为理想[5]。但因不同造模操作者的熟练程度不同、线栓穿插深浅的差异等原因，最终造成大鼠缺血区大小不一，造模后大鼠存活率下降，难以保证只有特定区域(如皮质区)发生缺血，因此在科研实验中存在一定的局限性。而光化学诱导动物模型的血栓形成部位可以随意控制，准确定位，方法操作简便，动物存活率高，对动物的损伤相对较小，稳定性和重复性也较好[7]；但其需要开颅，这在一定程度上破坏了颅内结构的完整性，故而影响了其实用价值。

在判断脑缺血造模结果方面，脑组织厚片TTC染色是常用的方法[8]，但因其需处死动物，故不利于后续实验研究。近年来，小动物磁共振成像技术逐渐兴起。该方法可直接显示缺血区所在的部位、大小、范围，成像分辨率高，且为非侵袭性检查手段。如果结合各脑区结构及功能分析，对于干预效应的机制研究具有重要作用。同时，利用磁共振的多参数成像可以更仔细地了解神经血管的状态，并可为干预和评价提供客观的影像资料[9]。

本研究结果显示，传统的造模方法造成的梗死灶范围较大，水肿面积大，在一定程度上波及皮质、海马区外的脑区。这些脑区的改变将影响神经细胞或胶质细胞结构的改变，进一步影响其功能的发挥。这些非实验预期的改变，可以通过小动物磁共振预先发现，及早处理可避免后期进一步干扰相关实验指标的检测。同时，可以让科研人员及时调整或改进造模方式，在某种程度上也可减少预实验的时间，为后期客观的实验结果奠定基础。

机体中脑血管网最完善，血管与血管之间以侧支沟通以保证脑的氧和葡萄糖供应[10]。一旦血管堵塞，缺血损伤的大小及发展速度与所累及部位的侧支供血潜力密切相关[11]。本研究结果也显示，MCAO造模后大脑中动脉供血深部区域缺乏侧支循环，内囊与纹状体的梗死明显早于具有丰富侧支的皮质，造成大范围的缺血[12]。而光化学诱导缺血造模不会波及内囊及纹状体，缺血及缺血区的恢复仅局限在光照区域，脑内大部分区域结构均未受破坏。大多数神经细胞于脑缺血发生后几小时内变性坏死，而新生血管则需要几天的时间生成，因此血管新生之前很多神经细胞均已坏死消失[13]。本研究磁共振成像也显示，两种缺血模型缺血边缘区均存在不同程度的血管新生。

目前国内外研究缺血性脑损伤的动物模型中，应用MCAO比较多，应用光化学诱导相对较少。Choi等比较了MCAO与光化学诱导模型动物的神经行为缺陷与动物模型脑梗死体积的关系[14]，结果显示MCAO模型大鼠脑总梗死体积呈时间依赖性增加，神经功能评分和行为缺陷与梗死体积呈正相关；而光化学诱导模型大鼠脑梗死体积相对平稳，无时间依赖性增加，梗死体积与神经行为异常的相关性较差。Yang等结合光学相干断层成像技术研究光化学诱导模型在缺血性梗死血管空间、血管神经元的功能恢复等研究中的独特作用，结果显示缺血损伤后远端大、中脑动脉能自发性再通，小脑皮质微血管伴随着新出现的血管从外周进入核心区呈再灌注状态，而皮质毛细血管恢复能力较差[15]。

本研究同时从亚显微水平比较两种造模方法的差异。MCAO造模造成脑内神经组织炎症反应，大量神经细胞及神经胶质细胞水肿，血管内皮肿胀，血脑屏障破坏严重，通透性增加，梗死灶范围较大，成活率降低，模型成功率大大下降。光化学诱导法导入的光敏物质易形成血栓，引起微血管损伤，造成动脉闭塞，观察全身血液循环系统变化较困难；可能出现内皮细胞损害、血脑屏障损坏和血管源性脑水肿等病理变化；或者因大鼠自身具有恢复能力，可能无法进行长时间的实验观察和疗效验证。但光化学诱导血栓模型缺血范围较小且稳定，神经细胞肿胀较小，血管炎性渗出减少，血脑屏障破坏相对较少。结合磁共振影像和超微结构分析，此两种造模方法各有优缺点，MCAO模型较适合长期实验的观察研究，适用于与功能恢复有关的预防、血管损伤保护或治疗化合物的研究；光化学诱导模型适合急性期或针对特定脑区的干预机制研究，有助于聚焦病灶导致位置相关的行为改变等研究。