卢 倩，刘梦佳，张令强，邹丽萍,

1首都医科大学脑重大疾病研究中心，北京脑重大疾病研究院，北京 100069；2解放军总医院第一医学中心 儿内科，北京 100853；3军事科学院军事医学研究院生命组学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，北京 100850

癫痫是一种常见的神经系统疾病，主要表现为神经元异常放电、反复痫性发作，全世界约7 000万的癫痫患者，虽然抗癫痫药物不断发展，但仍然有近1/3的患者发作难以控制[1]。癫痫病因复杂，主要包括结构、基因、感染、代谢、免疫和未知原因等[2]。反复的癫痫发作不仅对患者造成严重的伤害，还给其家庭和社会带来负担，因此对于癫痫发病机制的研究显得尤为重要。细胞内的蛋白翻译后的修饰过程称为蛋白泛素化，主要由泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)介导。UPS由泛素分子 (ubiquitin，Ub)、泛素激活酶(Ub-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(Ub-conjugating enzymes，E2)、泛素连接酶(Ub ligases，E3)、去泛素化酶 (deubiquitinases，DUBs)等构成[3]。UPS参与多种生命过程，如细胞周期的调控和发育、翻译调节、DNA修复、信号转导和蛋白的降解等[4]。泛素化过程异常可以引起多种疾病，最近有文献报道蛋白泛素化异常导致癫痫，如UBE3A(ubiquitin-protein ligase E3a)是一种E3，功能缺失可导致Angelman综合征[5]；Malin是由EPM2B编码的E3，Malin功能异常可导致Lafora疾病[6]；NEDD4-2(neuronal precursor cell expressed developmentally downregulated 4-2)调节细胞内吞及离子通道的溶酶体降解，与神经元兴奋性及癫痫有关[7]；NEDL2(NEDD4-like ubiquitin protein ligase-2)突变与神经发育落后、癫痫相关[8]。NEDL1又称为HECW1，是含有HECT结构域的E3。NEDL1在脑中特异性高表达，其次是肾，其氨基酸序列在鼠与人中相似度达到78%[9]。文献报道NEDL1与肿瘤及家族性肌萎缩侧索硬化相关[9-10]。目前尚无NEDL1与神经系统疾病相关的报道，我们通过建立Nedl1基因敲除鼠匹鲁卡品癫痫模型，研究NEDL1与癫痫的关系。

对象与方法

1 实验动物 选择C57BL/6小鼠通过Cre-Loxp系统构建Nedl1-/-小鼠。第一只Nedl1-/-小鼠来自军事科学院军事医学研究院生命组学研究所，我们将Nedl1-/-小鼠和Nedl1+/+小鼠进行合笼，产下F1代为杂合型小鼠，再将杂合型小鼠杂交，得到Nedl1-/-小鼠，我们通过对小鼠尾部提取的DNA进行PCT鉴定基因型[11]。小鼠于SPF级动物房饲养，湿度40% ～ 70%，室温20℃～ 25℃。所用的垫料、饲料、饮水均经过高压灭菌处理，实行自由饮食、饮水，垫料每周更换两次。选择8周龄的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠进行试验。

2 匹鲁卡品癫痫模型的制作 选取8周的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠。腹腔注射给药，首先给予2 mg/kg的甲基东莨菪碱(美国Sigma-Aldrich)、硫酸特布他林，主要用于拮抗匹鲁卡品导致的周围胆碱能受体的兴奋作用。30 min后腹腔注射盐酸匹鲁卡品(美国Sigma-Aldrich)，剂量为245 mg/kg(经过前期预实验得出药物剂量)。视频记录并观察小鼠的表现。癫痫的发作严重程度等级是按照Racine量表进行分级评估的。Racine[12]癫痫分级标准：1级，面部肌肉抽搐，有眨眼、动须、节律性咀嚼等动作；2级，出现点头的动作；3级，一侧前肢出现阵挛；4级，双侧前肢出现阵挛；5级，失去平衡摔倒。2 h后给予10%水合氯醛控制癫痫发作，剂量为2 ml/kg。选择2 h内发作达3级以上并且发作次数在3次以上，即达到癫痫持续状态(status epilepticus，SE)[13]的小鼠进行下面实验。

3 组织染色 小鼠麻醉后断头取出脑组织冠状切面，常规Nissl染色，光学显微镜下细胞计数及细胞形态观察。将脑组织用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋。将5μm后切片脱石蜡，血清封闭，加入一抗NPY(Abcam，1∶100)，加入荧光二抗(荧光标记羊抗兔IgG为1∶100)，加入DAPI溶液避光孵育，封片。

4 统计分析 使用SPSS20.0进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以表示，两样本均数的比较，采用t检验；不符合正态分布，使用Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。使用Image Pro Plus 6.0分析NPY免疫荧光染色，使用GraphPad Prism 6进行图表制作。

结 果

1 匹鲁卡品癫痫模型制作 选择Nedl1+/+小鼠(28只)和Nedl1-/-小鼠(17只)进行匹鲁卡品癫痫模型制作，腹腔给药后几分钟，小鼠出现活动减少，尾巴伸直、点头、腹部贴地爬行、全身抖动，偶尔出现阵挛发作。通过对不同基因型的小鼠癫痫模型后2 h发作情况进行统计。癫痫发作等级：Nedl1-/-小鼠癫痫发作等级显著低于Nedl1+/+小鼠(3.40±0.36 vs 3.90±0.16)(P=0.000)；2 h内 3级及以上癫痫发作的次数：Nedl1-/-小鼠癫痫发作次数显著少于Nedl1+/+小鼠(13.05±7.84 vs 20.00±8.47)(P=0.004)；首次出现3级以上发作的时间：Nedl1-/-小鼠所用时间明显长于Nedl1+/+小鼠(42.23±15.48 vs 24.4±17.06)(P=0.016)，差异均有统计学意义。癫痫模型后Nedl1-/-小鼠全部存活，而Nedl1+/+小鼠死亡13只(46.4%)(图1)。

图1 视频统计不同基因型小鼠癫痫发作严重程度[Nedl1-/-组n=17； Nedl1+/+组n=15 (A、B、C)， Nedl1+/+组n=28 (D). aP＜0.05]A：Racine等级； B：2 h内3级及3级以上发作的次数； C：首次出现3级及以上癫痫发作的时间； D：死亡情况Fig. 1 Video statistics of the severity of seizures in mice (n[Nedl1-/-]=17; A-C: n[Nedl1+/+]=15; D: n[Nedl1+/+]=28. aP＜0.05)A: the grading of seizures using Racine scale; B: the number of seizures at stage 3-5 (Racine scores) in 2 hours; C: the time interval of status epilepticus (SE); D: mortality rate of epileptic model

图2 癫痫模型建模后1个月Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠海马Nissl染色结果(n=3)A ～ D： Nedl1+/+未造模组； E ～ H： Nedl1-/-未造模组； I ～ L： Nedl1+/+癫痫模型后1个月； M ～ P： Nedl1-/-癫痫模型后1个月； Q： 癫痫模型后1个月两组海马各个区域细胞计数； R ～ S： 未造模和癫痫模型后1个月在海马CA1、 DG区细胞计数Fig. 2 Nissl staining results in hippocampus of Nedl1+/+ mice and Nedl1-/- mice at 1 month after establishing the epileptic model (n=3)A-D: Unmodeled Nedl1+/+ mice; E-H: Unmodeled Nedl1-/- mice; I-L: Nedl1+/+ mice 1 month after the epileptic model; M-P: Nedl1-/- mice 1 month after establishing the epileptic model; Q: cell counts of the hippocampus in the two groups 1 month after the epilepsy model;R-S: cell counts in CA1, DG area of hippocampus between unmodeled and epilepsy model; aP＜0.05

2 癫痫模型后小鼠脑组织Nissl染色比较 选择未造模及癫痫模型后1个月的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠各组3只，取脑组织进行Nissl染色。癫痫模型后1个月，低倍镜下观察(40×)见Nedl1+/+小鼠与Nedl1-/-小鼠海马区域整体结构无明显差异；高倍镜下观察(400×)可见Nedl1+/+小鼠CA1区、CA3区和DG区细胞着色增加，细胞排列紊乱，并且DG区的细胞明显固缩，细胞形态改变。癫痫模型后1个月，Nedl1+/+小鼠海马CA1区细胞计数明显低于Nedl1-/-小鼠(P=0.03)，并且较未造模时期明显减少(P=0.01)。癫痫模型后1个月，Nedl1+/+小鼠及Nedl1-/-小鼠海马CA3区、DG区细胞计数无明显差异，与未造模时期相比无明显变化(P＞0.05)(图 2)。

3 癫痫模型后小鼠脑组织NPY免疫荧光染色比较癫痫模型后1个月Nedl1+/+小鼠与Nedl1-/-小鼠(各3只)海马NPY(表示苔藓纤维发芽情况)免疫荧光染色比较，CA3区虽无统计学差异(P=0.36)，但是Nedl1-/-小鼠免疫荧光明显较Nedl1+/+小鼠弱。在DG区，Nedl1+/+小鼠免疫荧光染色较Nedl1-/-小鼠明显增多(P=0.03)，并且在海马上齿状回上颗粒层出现NPY免疫荧光，Nedl1+/+小鼠苔藓纤维发芽较Nedl1-/-小鼠明显(图3)。

图3 癫痫模型后1个月海马NPY免疫荧光染色(n=3)A、 C、 E： Nedl1+/+癫痫模型建模后1个月； B、 D、 F：Nedl1-/-癫痫模型后1月； G ～ H：两组海马CA3区和DG区NPY免疫荧光比较Fig. 3 NPY immuno fl uorescence staining results in hippocampus of Nedl1+/+ mice and Nedl1-/- mice at 1 month after establishing the epileptic model (n=3)A, C and E: Nedl1+/+ mice 1 month after establishing the epileptic model; B, D and F: Nedl1-/- mice 1 month after establishing the epileptic model; G-H: NPY immuno fl uorescence in the CA3 and DG of the hippocampus between Nedl1+/+ and Nedl1-/- (aP＜0.05. Arrows on the granular layer of the dentate gyrus NPY immunofluorescence indicates mossy fi ber sprouting conditions)

讨 论

Nakagawara[14]在神经母细胞瘤患者的肿瘤组织中发现NEDD4 E3同源的基因KIAA0322，由于该基因编码的蛋白有N端的C2区域、两个WW区域和C端的HECT结构域，因此将这个新发现的基因命名为NEDL1。NEDL1在神经系统特异性高表达，目前对NEDL1研究较少，主要集中在肿瘤方面和肌萎缩侧索硬化症。我们课题组前期通过对Nedl1+/+小鼠与Nedl1-/-小鼠脑、肾、心脏、肌肉、肝、脾等组织H&E染色比较，发现两组无明显差异，提示NEDL1并不影响小鼠生存[11]。

本研究中应用NEDL1基因敲除小鼠，建立匹鲁卡品癫痫模型，文献中关于匹鲁卡品使用的剂量没有明确的规定，单次腹腔给药剂量从175 mg/kg到400 mg/kg不等，小鼠未达到SE状态或死亡率差异较大，有文献报道175 mg/kg的药物剂量死亡率约25%，而也有文献报道400 mg/kg的药物剂量未达到SE状态或死亡率为70%[15-16]。我们经过前期的预实验后，发现剂量过大会导致死亡率较高，因此选择245 mg/kg的匹鲁卡品药物剂量进行试验。我们实验发现Nedl1+/+小鼠癫痫发作次数、发作等级及死亡率均较Nedl1-/-小鼠严重，并且发现癫痫模型后Nedl1+/+小鼠海马CA1及DG区神经元改变明显，Nedl1+/+小鼠海马DG区苔藓纤维发芽明显。

NPY是由36个氨基酸组成的肽类，在哺乳动物中枢神经系统的GABA能中间神经元中广泛表达[17-18]。NPY免疫反应性以及相对应的Y2受体在颞叶癫痫患者的海马表达增加，在反复癫痫发作的啮齿动物脑中表达也增加[19]。在海马齿状回上颗粒层的NPY表达可以反映苔藓纤维发芽[20]。Borges等使用CF1小鼠并建立匹鲁卡品癫痫模型，全部CF1小鼠在癫痫31 d时在海马上齿状回上颗粒层出现NPY的表达，反映苔藓纤维发芽情况。我们的实验中发现癫痫1个月后Nedl1+/+小鼠NPY免疫荧光较Nedl1-/-小鼠强，并且在Nedl1+/+小鼠齿状回上颗粒层发现有NPY荧光染色，说明Nedl1+/+小鼠苔藓纤维发芽情况较Nedl1-/-小鼠严重，加重癫痫的发作。

p53是具有多种功能的蛋白，其可以调节细胞周期、细胞分化、DNA修复及自噬，文献报道p53过度表达可致海马神经元死亡[21-22]。长期颞叶癫痫患者海马的p53水平升高[23]。已经发现p53缺乏小鼠癫痫模型皮质及海马神经元死亡减轻，p53抑制剂可减轻癫痫后神经元死亡[24-25]。NEDL1可增强p53的转录活性及促凋亡功能，在肿瘤中发挥重要作用。本研究中Nedl1基因敲除小鼠匹鲁卡品模型癫痫发作及脑组织病理改变程度均较Nedl1+/+小鼠轻，可能为Nedl1基因敲除后，p53表达减低，因此癫痫发作时神经元损害减少，癫痫发作减轻。本研究为控制癫痫发作提供了新思路，将来仍需进一步实验证明。