盛 炜，张 丽，李美蓉，付小兵

1解放军总医院 医学创新研究部创面治疗中心，北京 100853；2解放军总医院第二医学中心 康复医学科，北京 100853；3解放军总医院 医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心，北京 100853

慢性创面治疗是创伤研究领域的难题[1]。体外冲击波疗法(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)作为能量医学和物理医学相结合的新型治疗方法，具有安全、无创、有效的特点，其不仅在难愈性骨折、肌腱末端病等肌骨疾病的治疗中广泛应用[2-4]，在创面修复，包括急、慢性创面的临床治疗中亦显示出独特优势。多个研究团队均证实ESWT可促进糖尿病足创面、血管病变相关创面等多种慢性创面愈合，初步表明ESWT治疗慢性创面的有效性和安全性[5-10]。2017年底，美国FDA批准ESWT用于糖尿病慢性创面的临床治疗，标志着ESWT已经正式成为慢性创面的临床治疗手段，同时也进一步显示了ESWT的应用前景和研究潜力[11-12]。深入地探讨ESWT的作用机制，一方面将为ESWT在临床的应用提供理论依据；另一方面将为深入认识ESWT的作用机制提供新的研究方向和靶点，而目前对ESWT促进创面修复的主要作用机制及信号传导通路尚不清楚，现将相关研究进展综述如下。

1 冲击波的概念及物理特性

冲击波(shock wave，SW)是一种通过振动或者高速运动导致介质极速压缩、聚集而产生的机械能量波[13-14]。冲击波能量具有方向性，能在极短的时间内(＜10 ns)释放较强的峰值压力(可高达100 MPa)，在介质中传播时可引起介质的压强、温度、密度等物理性质发生显著的、跳跃式的改变，从而产生一系列物理学效应。1)机械效应：冲击波在不同介质的交界处加压和撤压而产生的牵张效应；2)空化效应：当冲击波强度超过一定值时，存在于介质中的微气核空化泡振动进而发生牵伸和崩溃所产生的效应；3)热效应：冲击波在生物体内传播过程中，其振动能量被组织吸收而转化为热量的效应[13,15-16]。

2 ESWT生物学效应的启动机制与机械敏感性离子通道

作为一种机械能量，冲击波是如何在生物体的组织或细胞内由机械力学信号转化为生物学信号，进而产生生物学效应的呢？这是探索ESWT作用机制的根本性问题。

已经证实，机体细胞能够感受细胞外环境中的机械应力刺激，主要是因为其细胞膜上存在着特异性机械敏感性离子通道(mechanosensitive ion channel，MSIC)。MSIC是一类感受细胞膜表面应力变化，实现细胞外机械信号向细胞内转导的离子通道，根据通透性分为离子选择性和非离子选择性通道，根据功能作用分为张力激活型和张力失活型离子通道[17]。当冲击波的机械应力刺激细胞时，细胞膜结构发生弹性形变，激活细胞膜上的MSIC蛋白，从而产生一系列生物学效应。目前，研究已经证实MSIC主要有以下通道蛋白：Pannexin蛋白通道、Piezo非选择性阳离子通道(Piezo1蛋白离子通道和Piezo2蛋白离子通道)、退行性蛋白离子通道(DEG)/上皮钠通道离子通道(ENaC)/酸度激活性离子通道(ASIC)、瞬时电位感受性离子通道通道(TRP)以及双孔钾通道(K2P)等。

2.1 Pannexin蛋白通道 Pannexin蛋白广泛存在于骨与软骨、皮肤、肌肉等多种器官和组织的细胞中，是构成细胞间隙连接(gap junction，GJ)的重要结构，其家族包括Pannexin1、Pannexin2和Pannexin3，其中Pannexin1(Panx1)蛋白可以特异性感应机械应力刺激[18-20]。Panx1蛋白结构包括4个跨膜结构域、2个细胞内氨基端、2个细胞外环状结构、2个羧基端(图1)[20-21]。常规情况下，Panx1蛋白以封闭式的半通道存在；在机械能量刺激下，细胞膜上的Panx1蛋白分子结构发生改变，形成开放性GJ通道，使离子和大分子物质如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)得以跨膜运动[21]。研究显示，ESWT机械能量可刺激MSCs、ASCs以及T细胞等多种细胞的细胞膜Panx1蛋白，引起胞内ATP的外向释放，当细胞外ATP浓度达到1.0 ～ 6.9μmol/L时，就足以激活细胞膜上的P2X7受体[22-23]，提示ESWT刺激细胞膜Panx1蛋白进而促使胞内ATP的外向释放，是ESWT生物学效应的启动机制和重要环节[22-23]。

图1 Pannexin蛋白结构及通道示意图Fig. 1 Schematic diagram of Pannexin protein structure and channels

2.2 Pizeo蛋白通道 在脊椎动物中存在两种类型的Piezo蛋白，即Piezo1蛋白和Piezo2蛋白[24]。Piezo1蛋白由FAM38A基因编码，由2 500个氨基酸构成，拥有24 ～ 40个跨膜结构域，是一种巨大的跨膜蛋白，广泛分布于皮肤、内皮细胞、红细胞、膀胱、肺等真核细胞中。Piezo1通道呈现三聚体三叶螺旋桨状结构(图2)，其中心为控制离子通透的孔道部分[25]。不同于其他离子通道类型，Piezo1通道的跨膜区以大曲度、而非平面形式存在，这可能是Piezo通道能有效感知细胞膜机械应力变化的重要结构基础之一[26]。研究发现，Piezo1通道可以非选择性通过Ca2+、Mg2+、Mn2+等二价离子以及K+、Na+等一价碱性离子。Piezo1通道是与细胞骨架的整合素蛋白密切相关，可以由整合素的结构改变造成离子通道的开放和关闭。Piezo1蛋白通道在机械应力刺激下可增加细胞质中Ca2+以及谷氨酰胺转移酶的活性，以Ca2+离子作为机械信息的第二信使，参与细胞的黏附与迁移功能调节[27]。Piezo2蛋白由2 800个氨基酸构成，由FAM38B基因进行编码，主要分布于三叉神经感觉细胞、背根神经节细胞、Merkel细胞中，参与调节细胞应对机械刺激所介导的感觉功能以及炎性介质的释放与表达[27-28]。

2.3 退行性蛋白通道(DEG)/上皮钠离子通道(ENaC)/酸度激活性离子通道(ASIC) DEG/ENaC通道有2个跨膜序列和1个大型的富含半胱氨酸的环状结构延伸到细胞外，在细胞内有相对较短的氨基末端/羧基末端。研究表明，ENaC可能通过位置蛋白磷酸化来调节骨细胞生长，但其具体机制尚不明确。当细胞受到机械应力刺激时候可引起整合素-细胞骨架复合体的构象变化，改变MSIC，使细胞内Ca2+水平升高，触动酪氨酸激酶磷酸化，从而激活第二信使系统，启动应力反应元件(stress responsive element，SRE)，调节细胞的分化、代谢和凋亡。

2.4 瞬时电位感受性(TRP)通道 TRP通道包括6个跨膜功能区，被证明是一种渗透压感受器，在炎症过程中，可以使痛觉神经元对渗透压及机械刺激产生痛觉过敏。

2.5 双孔钾(K2P)通道 K2P离子通道具有4个跨膜功能区和2个前后排列的孔道，可分成TWIK、TASK、TREK和TRAAK四个亚型，其中TREK-1、TREK-2和TRAAK均是与机械应力信号转导相关的离子通路。研究表明K2P通道可以改变细胞的微丝微管等细胞骨架结构，而TREK-1多位于中枢神经系统中。

3 ESWT生物学效应的信号通路研究

ATP不仅是细胞内的重要能量物质，而且还可以作为一种自分泌或旁分泌的生物学信号，调节细胞的病理生理功能。常规情况下，细胞外ATP浓度维持在极低水平，当其浓度升高到一定水平(0.1 ～ 1μmol/L)时，就可结合并激活细胞膜上的特异性2型嘌呤信号(type 2 puriengic signaling，P2)受体[18,29]。P2受体主要包括P2X和P2Y两大家族，其中P2X受体是一种配体门控离子通道，有7个亚型。Minns等[30]观察到，在上皮细胞的增殖过程中，P2X7受体的表达增加。细胞外的ATP主要结合并激活细胞膜P2X7受体，使细胞内MAPK激酶(MAPKK)磷酸化，从而活化MAPK信号通路。进一步的反向验证实验显示，当分别应用Panx1蛋白抑制剂、P2X7受体抑制剂或者ATP水解酶干预后，细胞内的MAPK激酶乃至整个MAPK信号通路的活化都会受到抑制，同时MSCs、ASCs以及T细胞的增殖和分化过程也会受到抑制，进一步佐证了Panx1蛋白、ATP外向释放以及后继的P2X7受体激活是ESWT在多种细胞产生生物学效应的关键信号通路[18,22-23]。

有丝分裂源活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是广泛存在于真核细胞和原核细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的凋亡与分化的信号通路，介导细胞增殖和分化、组织修复等生、病理过程[19,31]。ATP的外向释放和P2X7受体的激活可使细胞内的MAPKK磷酸化，进而激活MAPK信号通路[22-23]。MAPK信号通路包括细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)、c-Jun N 端 激 酶 (Jun-N terminal kinase，JNK)信号通路、p38 MAPK三条通路，是细胞外信号引起细胞核内反应、调控细胞功能活动的重要枢纽，在多种细胞的增殖、分化以及细胞间的功能协调中发挥关键作用[23]。MAPK活性通路降低时，细胞自我更新能力下降、增殖潜能丧失。研究显示，MAPK信号通路存在不同程度的功能障碍，是慢性创面的发生机制之一[32]。

在MAPK信号通路中，ERK1/2是一种典型的MAPK通路，只能接受其上游细胞外的信号调节激酶的调节。有研究表明，MAPK/ERK1/2可以被体外机械应力所激活，而且呈现出时间依赖性和强度依赖性等特征；而ERK5是一种非典型的MAPK通路，有研究报道MAPK/ERK5可以被体外机械应力刺激直接激活。在血管内皮细胞、破骨细胞的研究中，已经证实了体外机械应力对MAPK/ERK5的激活作用。据此，可以推测MAPK/ERK5可能是机械敏感性离子通道所介导细胞产生生物学效应的下游信号分子。

图2 Piezo1通道的三聚体冷冻电镜示意图Fig. 2 Achematic diagram of the trimer cryo-EM of Piezo1 channel

另外，MAPK信号通路在ESWT促进多种细胞的增殖和分化过程中具有关键作用。侯向锋等[22]发现低能量冲击波可刺激MSCs内p38MAPK激酶磷酸化，且磷酸化程度与冲击波治疗剂量呈正相关关系，提示ESWT可能通过p38MAPK激酶激活MAPK信号通路，进而促进MSCs增殖并向成骨细胞分化；凌琳[33]采用低能量冲击波刺激兔膝骨关节软骨细胞，其再生能力增强，同时ERK、JNK蛋白表达水平也在ESWT干预后显著升高，提示ESWT可能是通过调控细胞内MAPK信号通路蛋白ERK、JNK蛋白的表达而实现的；Weihs等[23]应用中-低能量冲击波(能量密度：0.03 ～ 0.19 mJ/mm2)分别刺激小鼠MSCs、人ASCs以及T细胞三种不同类型的细胞后，结果发现三种细胞的增殖能力均明显增强，其细胞代谢水平增加，同时发现嘌呤信号诱导的ERK MAPK和p38 MAPK激酶在冲击波作用后快速活化，且其活化程度均与冲击波能量呈正向剂量-效应关系，由此进一步佐证了MAPK信号通路调控细胞的增殖、迁移和分化功能可能是ESWT促进组织修复的重要效应途径(图3)。

4 ESWT促进慢性创面愈合的细胞学研究

目前，ESWT对机体的生物学效应主要包括诱导细胞或干细胞的增殖和多向分化、促进新生血管形成以及循环改善、调节局部炎症反应以及缓解疼痛等[7,34]。组织修复细胞对创面愈合起着决定性的作用。有效激活创面局部修复细胞的增殖、分化和迁移，对于加速慢性创面的愈合具有积极作用和重大意义。

研究发现，ESWT所携带的机械性能量刺激能够诱导组织修复的关键细胞——成纤维细胞的增殖以及干细胞的多向分化：成纤维细胞是一种机械敏感性细胞，ESWT机械能量刺激可以通过细胞的机械信号传导来调节细胞的生物学功能[35-36]。Berta等[37]采用ESWT体外刺激成纤维细胞后，ESWT刺激组成纤维细胞的增殖效率明显提高，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)及Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达也显著高于对照组，提示创面局部及周围组织的成纤维细胞的功能被ESWT所激活；Cai等[38]发现ESWT刺激成纤维细胞后，其细胞因子IL-6和IL-8表达水平升高，而TNF-α表达水平下降；动物水平的缺血性皮瓣移植创面，在ESWT干预后，皮瓣缺血性坏死面积明显减少，细胞凋亡比例降低，创面组织中成纤维细胞数量增加，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、内皮型一氧化氮合酶以及脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase，RPH)的表达明显增强，而CD45、活性氧自由基，如8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxyguanosine，8-OG)、H2O2的表达也显著减少，提示ESWT的作用机制涉及氧自由基代谢、炎性细胞浸润、细胞凋亡过程的调节以及皮肤成纤维细胞募集等，从而在缺血性慢性创面的治疗中发挥积极作用[39]；Aschermann等[40]在下肢慢性创面的研究中发现，ESWT可刺激细胞形态发生改变，加速角质细胞迁移；细胞增殖周期调控基因表达上调，成纤维细胞增殖加快；同时伴随着炎性细胞因子分泌及新生血管的形成。Hausdorf等[41]发现人成纤维细胞经ESWT刺激后，FGF-2和TGF-β水平显著升高(P＜0.05)，提示ESWT能够促进创面修复相关的生长因子合成和(或)释放。

图3 Panx1蛋白-ATP释放-MAPK信号通路与ESWT作用机制Fig. 3 Panx1 protein-ATP release-MAPK signaling pathway and ESWT mechanism

在干细胞领域，ESWT能够促进间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)、肌腱来源的干细胞/祖细胞(tendon-derived stem/progenitor cells，TSPCs)、脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)等多种来源干细胞的增殖和多向分化。Leone等[35]发现，在离体状态下，ESWT可刺激TSPCs增殖和分化加速；李众利等发现，ESWT不仅能促进MSCs的增殖和成骨分化能力，而且还可刺激MSCs分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和 CXC 趋化因子配体(CXC ligand，CXCL)，促进新生血管形成和神经再生[42-43]；此外，ESWT还能显著提高ASCs的增殖能力，同时刺激其向脂肪细胞、成骨细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞的多向分化能力[2,44]。

综上，现有研究证据表明，细胞膜上的机械信号敏感性感应蛋白及离子通道激活可能是ESWT的重要作用靶点和启动机制，而MAPK信号通路可能是机械敏感性离子通道所介导细胞生物学的下游信号分子。修复细胞在机械能量的刺激下，其增殖、分化和迁移活性发生改变是促进创面愈合的细胞学基础。但更为具体的效应机制有待于更为深入的基础研究和证据支持。