吴冬梅,张晓东

(1.河南省中医院，河南 郑州 450002； 2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)以持续无排卵、高雄激素含量和胰岛素抵抗为特征[1-3]。PCOS患者主要表现为胰岛素抵抗(insulin resistance,IR) 和代偿性高胰岛素血症，是引起月经不调、闭经和不孕的常见原因之一，还与其他心脑血管疾病的发生密切相关[4-5]。遗传因素、下丘脑-垂体-性腺轴功能失调、卵巢及肾上腺功能异常、胰岛素抵抗、肥胖[6]都与PCOS的发病有联系。脂肪组织是人体重要的能量稳态调节器，是触发胰岛素抵抗炎症反应的重要场所，脂肪组织分泌功能紊乱在IR中扮演了重要的角色。荷叶是一种被广泛研究的植物化学物，但其对前脂肪细胞增殖、分化、凋亡的影响，以及相关机制仍不明确。本研究检测荷叶对3T3-L1脂肪细胞的影响，以期从分子生物学角度阐述荷叶降脂的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

荷叶，购自河南中医药大学第一附属医院药房，水煮提取，高压灭菌，制备中药水溶性提取物(extracts of Chinese medical herbs,ECMH)，4 ℃备用。DMEM培养基，美国Gibco公司产品，批号12100046；胰蛋白酶(批号20160302)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，批号20150120)，均为北京Solarbio公司产品；荧光定量 PCR Mix(批号A25741)、逆转录试剂盒(批号18090050)，均为美国Thermo Fisher公司产品；TRIZOL试剂，美国Invitrogen 公司产品，批号15596026；胰岛素(批号I0516)、地塞米松(DEX，批号D4902)、 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，批号17018)、油红O(批号O0625)，均为美国Sigma公司产品。96孔细胞培养板，美国Costar公司产品，批号3516；OLYMPUS CK40 倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯公司产品；CO2细胞培养箱，美国Thermo公司产品；高速台式冷冻离心机，德国Herseus公司产品；ABI7300荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司产品；Milli-Q型超纯水仪，美国Milipore公司产品。

1.2 细胞培养与传代

3T3-L1细胞，购自上海细胞所。将 3T3-L1细胞在含有100 IU/L青霉素100 mg/L链霉素、体积分数100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养基、37 ℃、体积分数50 mL/L CO2条件下培养。生长至90%传代培养。取传代2～3代后的细胞进行种板并进行后续实验。

1.3 检测指标

1.3.1 荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞增殖的影响

采用MTT法检测。细胞以1×105/mL密度接种到96孔板上，培养24 h至生长融合后将细胞分为正常对照组和质量分数为0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷叶水提物组。正常对照组细胞进行正常培养；荷叶水提物各组以质量分数为0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷叶水提物分别刺激3T3-L1前体脂肪细胞24 h，再更换含5 g/L MTT液无血清培养基90 μL，继续培养4 h，然后用酶标仪测定490 nm处的吸光度。

1.3.2 荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞白介素-6(IL-6)信使核糖核酸(mRNA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA的表达

采用荧光定量PCR检测。将细胞接种于25 cm2培养瓶中，融合达到90%后随机分2组。荷叶组：加入5 mL含1g/L的荷叶提取物。正常对照组：加入5 mL 普通培养基， 继续培养24 h，处理结束后提取RNA；诱导分化的成熟脂肪细胞培养至第9天时按以上方法分组并加药，培养24 h后清洗细胞，提取细胞RNA。所得各组RNA根据逆转录试剂盒操作逆转录成CDNA，荧光定量PCR仪进行扩增。实时荧光定量反应条件，95 ℃预变性90 s；进入PCR循环，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。扩增反应结束后，从65 ℃缓慢加热到95 ℃，以建立PCR产物的熔解曲线，每个标本均设置复管PCR反应。以GADPH为内部对照，采用2-ΔΔCt相对定量法计算各组基因表达得出RQ 值进行计算和统计。

1.3.3 荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞凋亡的影响

采用DAPI染色法检测。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察。正常的细胞核呈亮蓝色荧光，细胞质无荧光。细胞发生凋亡时，细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染。方法如下：取对数生长的细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化成细胞悬液，接种到预先放置盖玻片的24孔培养板中，置37 ℃、体积分数为50 mL/L CO2的孵箱中培养，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，进行分组。正常组：加入5 mL 含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基。实验组：加入5 mL含1 g/L的荷叶提取物。继续培养24 h,取出盖玻片，PBS漂洗2次;加入DAPI饱和工作液60 μL ，室温避光作用10 min；PBS溶液洗涤3次，5 min/次；封片,在荧光显微镜下观察并照相。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞增殖的影响

见表1。各质量分数的荷叶提取物均可不同程度地抑制细胞的增殖，且呈现量-效关系。与正常对照组对比,各荷叶提取物组的OD值降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结合10 g/L的荷叶水提物组出现皱缩、脱壁、细胞脱落现象，决定取质量分数为1 g/L的荷叶水提物进行后续实验。

表1 不同质量分数荷叶水提对3T3-L1前体脂肪细胞增殖的影响

2.2 荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞 TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表达的影响

质量分数1 g/L的荷叶水提物能降低3T3-L1前体脂肪细胞IL-6 mRNA 表达，能增高3T3-L1成熟脂肪细胞TNF-α、IL-6 mRNA的表达 ，与正常对照组对比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 荷叶水提物对前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞 TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表达的影响

2.3 荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞凋亡的影响

见图1。正常对照组细胞在细胞核处发散微弱荧光，质量分数1 g/L的荷叶水提物组可见细胞凋亡。凋亡细胞的细胞核缩小、发散高亮荧光；细胞浆中可见局部稀疏亮点(线粒体DNA)。早期凋亡的细胞有明亮凋亡荧光。

A.正常对照组

B.1 g/L荷叶水提物组

3 讨 论

多囊卵巢综合征患者存在代谢异常，主要表现为肥胖、胰岛素抵抗、糖耐量损害和血脂异常等。PCOS的高雄激素血症及高胰岛素可改变脂蛋白及胆固醇的代谢而产生高脂血症，加重脂类代谢的异常，进一步导致动脉粥样硬化发生[10]。脂肪组织在人体中是一个重要的能量稳态调节器，脂肪蓄积过多可能导致胰岛素抵抗。肥胖症与糖尿病、冠心病、高血压、脂代谢紊乱及动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关，严重影响着人们的身心健康。脂肪组织的变化是肥胖症发生的根本原因，脂肪组织能分泌一些特异性蛋白，在机体糖脂代谢中起着重要的调节作用，此成为治疗肥胖症的新靶点。IL-6是多功能炎性细胞因子,具有致炎和抗炎的双向功能，在炎症反应中起重要作用。其作用与组织中的含量有关,正常水平的白介素对机体有利,过多则会引起炎性损害。

MTT实验结果显示：0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的ECMH可不同程度抑制脂肪细胞的增殖，随着药物质量分数的升高，呈明显的剂量-效应关系。与正常对照组对比，各质量分数的荷叶水提物都可以不同程度抑制细胞增殖，且质量分数越高，对脂肪细胞的抑制作用越强。但荷叶水提物质量分数过高，会使脱落细胞增多，因此实验中选取1 g/L的ECMH进行荧光定量PCR实验。荧光定量PCR结果显示：1g/L的荷叶水提物能降低3T3-L1前体细胞IL-6 mRNA的表达，增高成熟脂肪细胞TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表达。DAPI染色实验结果显示：荷叶水提物可以显著促进脂肪细胞的凋亡。