石磊 李军祥 韩啸 刘佳丽 路琼琼 寇富舜 孙中美 丁庞华 毛堂友 王志斌

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种慢性非特异性炎性结直肠疾病，主要影响18～50岁的中青年，有腹泻、黏液脓血便和腹痛等症状。因本病难治愈、易复发、癌变风险高，UC已被世卫组织列为难治病。近年来，除常规治疗药物外，又新增了如：粪菌移植[1]、选择性白细胞吸附[2]等技术手段，但以上药物或疗法具有疗效不稳定、停药后易复发、不同程度的毒副作用、价格较贵等问题。中医药在诱导缓解、协同西药增效减毒、提高生活质量、预防复发等方面有较明显优势[3]。

清肠温中方是课题组带头人李军祥在继承董建华院士学术思想下，根据多年临床总结而成，特提出其病机属脾阳不足、湿热内蕴、瘀血内阻，治以温中健脾、清热燥湿、凉血化瘀。前期课题组在单中心的双盲双模拟RCT临床观察中发现，本方具有改善轻、中度活动期UC患者临床症状、降低疾病活动度并提高生活质量的疗效；动物实验也证实了该方具有减轻炎症、修复黏膜病变的作用。

为了进一步揭示本方的功效，本研究遵循“法依病机，拆方依法”的研究思路，将清肠温中方根据病机拆分为：温中健脾的炮姜、炙甘草；清热燥湿的黄连、青黛、苦参；凉血化瘀的三七、木香、地榆炭，并将以上三者两两组合，开展清肠温中方的拆方研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF级SD大鼠79只，体重(200±20)g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2016-0002)，常规饲养于北京中医药大学SPF级动物房，12小时光照/黑夜循环，温度(22±2)℃，湿度50%～60%，自由饮食饮水饲养。实验过程符合北京中医药大学学术委员会实验动物伦理分委员会制订的伦理要求。

1.2 主要试剂仪器

葡聚糖硫酸钠(0216011080，美国MP Biomedical)；大鼠IP10 Elisa试剂盒(CSB-E08182r，武汉华美生物工程有限公司)；大鼠CXCR3 Elisa试剂盒(JL13105，上海江莱生物科技有限公司)；小鼠抗HIF-1α单克隆抗体(ab1，美国Abcam)；小鼠抗Cytokeratin8单克隆抗体(ab9023，美国Abcam)；兔抗Vimentin单克隆抗体(ab92547，美国Abcam)；酶标仪(MultiSkan3；美国Therno scientific)；电泳仪(Mini Ge Tank，美国Therno scientific)；转膜仪(Mini Blot Module，美国Therno scientific)；病理切片机(LEICA2016，德国Leica)；显微镜(XSP-C204，上海巨纳科技有限公司)等。

1.3 实验用药

阳性对照药：美沙拉秦缓释颗粒(艾迪莎)，批号：170506，规格：0.5 g/袋。

中药：清肠温中方颗粒剂(黄连6 g、炮姜10 g、青黛3 g、苦参15 g、三七6 g、煨木香6 g、地榆炭15 g、炙甘草3 g)，由北京康仁堂公司生产加工，北京中医药大学东方医院提供。

1.4 拆方分组

根据病机将清肠温中方进行拆方、重组，具体分组：(1)温中健脾组：炮姜、炙甘草，两药合用起到温中健脾，温补中焦之用；(2)清热燥湿组：黄连、青黛、苦参，共奏清热燥湿之效；(3)凉血化瘀组；三七、木香、地榆炭，功效凉血化瘀，行气止痛；(4)温中健脾合清热燥湿组：炮姜、炙甘草、黄连、青黛、苦参；(5)温中健脾合凉血化瘀组：炮姜、炙甘草、三七、木香、地榆炭；(6)清热燥湿合凉血化瘀组：黄连、青黛、苦参、三七、木香、地榆炭；(7)全方组：清肠温中方全方，炮姜、炙甘草、黄连、青黛、苦参、三七、木香、地榆炭。

1.5 模型建立

所有大鼠于SPF级动物房适应性饲养1周后，将79只大鼠采用随机数字表法进行完全随机分组，共分10组，其中空白组7只，模型组、温中健脾组、清热燥湿组、凉血化瘀组、温中健脾合清热燥湿组、温中健脾合凉血化瘀组、清热燥湿合凉血化瘀组、全方组和美沙拉秦组，每组8只。除空白组外，其余大鼠连续7天自由饮用4%(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液以建立急性UC模型，饮用结束后，按不同的分组分别灌胃给药7天，与此同时，除空白组外的所有大鼠，仍需继续服用1% DSS溶液以维持小剂量刺激引起的病变[4]。

1.6 分组给药

本研究选用前期实验中效果最明显的中剂量为给药剂量(即临床患者口服用药的等效剂量)[4]。在实验的后7天，各组大鼠以相应药物的中药液或去离子水灌胃，每日1次，每次1 ml/100 g，具体用量：温中健脾组：1.37 g 生药/kg；清热燥湿组：2.52 g 生药/kg；凉血化瘀组：2.84 g 生药/kg；温中健脾合清热燥湿组：3.89 g 生药/kg；温中健脾合凉血化瘀组：4.20 g 生药/kg；清热燥湿合凉血化瘀组：5.36 g 生药/kg；全方组：6.72 g生药/kg；美沙拉秦组：(美沙拉秦缓释颗粒悬浊液)420.0 mg/kg。

1.7 标本取材

灌胃给药的第7天，所有大鼠禁食不禁水24小时，灌胃7天后于第8天取材。取材当天称重，按0.4mL/100g的剂量，腹腔注射10%水合氯醛溶液。腹主动脉抽取血液，静置2小时后，4℃条件下3000 rpm离心15分钟，留取淡黄色血清。留取数段肠管，PBS快速冲洗后，分别放于4%多聚甲醛和冻存管中，以进行病理和蛋白学相关检测。

1.8 结肠组织病理学评价

结肠组织在多聚甲醛固定24小时以上，经过洗涤、修块、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片。二甲苯脱蜡、梯度酒精、苏木精染色、分化、返蓝、伊红复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片，光学显微镜下观察评分。根据结肠组织学病理学评分标准[5]计算总分。评分内容分炎细胞浸润程度、肉芽肿和病变深度，无记0分，轻度记1分，中度记2分，重度记3分。

1.9 免疫组织化学染色

石蜡切片抗原修复、两步法染色，DAB显色、苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片。样本在高倍镜视野(×200)白平衡后进行拍照采图，Image J软件(National Institutes of Health, USA)分析图像，计算光密度(IOD)和染色区域总面积(area)，IntDen表示阳性蛋白相对密度，以area表示阳性染色蛋白分布及表达总面积，用平均光密度(AOD=IntDen/area)统计分析。

1.10 酶联免疫吸附实验

冻存血清室温解冻，按照Elisa试剂盒说明步骤进行操作。酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD 值)。

1.11 Western blot实验

制备结肠组织匀浆、蛋白抽提、BCA定量、浓度调整、灌胶、上样、电泳、转膜、封闭、一抗反应、二抗孵育、显影。以GAPDH为内参，Image J软件定量，结果以目的条带和内参的相对密度值表示。

1.12 统计学处理

2 结果

2.1 清肠温中方拆方对急性UC大鼠结肠黏膜组织学病变程度的影响

模型组可见炎细胞浸润、腺体萎缩和黏膜结构破坏，治疗后清热燥湿、温中健脾联合清热燥湿、温中健脾合凉血化瘀、全方和美沙拉秦组均能缓解组织学病变并降低病变评分见图1、表1。

注：A：空白组；B：模型组；C：温中健脾组；D：清热燥湿组；E：凉血化瘀组；F：温中健脾合清热燥湿组；G：温中健脾合凉血化瘀组；H：清热燥湿合凉血化瘀组；I：全方组；J：美沙拉秦组。

图1 各拆方组大鼠HE染色组织学光镜下肠黏膜组织病理图(200×)

表1 各拆方组大鼠组织学病变评分表

2.2 清肠温中方拆方对急性UC大鼠肠黏膜中细胞骨架蛋白的表达影响

免疫组化染色发现，大鼠肠黏膜中波形蛋白(VIM)表达量较多，而模型组表达量更多，均成强阳性染色，从AOD值来看，除温中健脾和温中健脾合凉血化瘀组外，其余干预药物均能减少其表达见图2、表2。

注：A：空白组；B：模型组；C：温中健脾组；D：清热燥湿组；E：凉血化瘀组；F：温中健脾合清热燥湿组；G：温中健脾合凉血化瘀组；H：清热燥湿合凉血化瘀组；I：全方组；J：美沙拉秦组。

图2 各拆方组大鼠肠黏膜中VIM蛋白的IHC染色图(200×)

表2 各拆方组大鼠IHC染色值表

角蛋白8(K8)在各组大鼠肠黏膜中表达量整体偏低，模型组几乎未见到阳性表达，治疗后除清热燥湿和清热燥湿合凉血化瘀组，其余药物均能促进表达，且与模型组比较，存在统计学差异。见图3。

注：A：空白组；B：模型组；C：温中健脾组；D：清热燥湿组；E：凉血化瘀组；F：温中健脾合清热燥湿组；G：温中健脾合凉血化瘀组；H：清热燥湿合凉血化瘀组；I：全方组；J：美沙拉秦组。

图3 各拆方组大鼠肠黏膜中K8蛋白的IHC染色图(200×)

此外，VIM/K8比值在DSS诱导的急性UC模型大鼠中明显升高，经各组药物干预后，该比值均有下降见表2。

2.3 清肠温中方拆方对急性UC大鼠血清炎性介质的含量影响

Elisa检测各组大鼠血清中干扰素γ诱导蛋白10(IP10)和趋化因子受体3(CXCR3)后发现，模型组大鼠二者均明显升高，除凉血化瘀组外，各拆方组干预后均能明显减少血清中两种炎性介质的含量。其中，清热燥湿、温中健脾合凉血化瘀和温中健脾合清热燥湿组对IP10的下调作用更加明显，效果优于全方和美沙拉秦；温中健脾合凉血化瘀和清热燥湿合凉血化瘀组则能更多地减少血清CXCR3含量，其下降作用略优于全方和美沙拉秦。见表3。

表3 各拆方组大鼠血清中炎性介质含量表

2.4 清肠温中方拆方对急性UC大鼠结肠组织缺氧环境的影响

本研究采用Western blot检测了各组大鼠结肠组织中的HIF-1α，结果发现虽然各组间不存在统计学差异，但模型组HIF-1α表达趋势高于空白组，各拆方组在治疗后也有减少的趋势，其中，以全方组减少作用最为明显，其次为温中健脾合凉血化瘀和温中健脾合清热燥湿组。见图4、表4。

注：A：模型组；B：空白组；C：美沙拉秦组；D：全方组；E：清热燥湿组；F：凉血化瘀组；G：温中健脾组；H：温中健脾合清热燥湿组；I：清热燥湿合凉血化瘀组；J：温中健脾合凉血化瘀组。

图4 各拆方组大鼠结肠组织中HIF-1α蛋白印迹图

表4 各拆方组大鼠结肠HIF-1α相对灰度值表[p50 (p25～p75) ]

3 讨论

UC病位在肠，与脾胃关系密切；病性属本虚标实，寒热错杂；本虚为脾阳不足，标实为湿热内蕴夹有瘀血；病因病机或为外感湿热，或为饮食不节，或为情志不畅，日久导致脾胃虚弱，运化失司，水湿内停，湿郁化热，湿热内蕴与肠道气血相搏结，气血凝滞，化为脓血，故见下利黏液脓血；肠道传导失司，气机阻滞，腑气不通，出现腹痛、里急后重；脾胃虚弱，脾阳不足，温煦失职，可有腹部冷痛，遇寒加重。

针对活动期UC，目前学术界多以清热化湿和凉血止血为主要治疗方法[6]，这一治法对泄泻、便血类疾病虽是效如桴鼓，但由于UC发生时多已存在脾胃虚弱之况，一味使用苦寒、寒凉之药只会徒增脾胃虚弱之累，甚至加重阳虚进程，这也是为何临床中活动期UC患者常伴有怕凉畏寒的原因之一；此外，凉血止血虽然能治疗一时出血之症，但对湿热与气血博结，同时存在脾阳虚弱的情况，单纯的止血只会加重气血瘀滞之势，进一步促使瘀血阻滞、新血不生，加重出血。因此结合临床经验，课题组带头人李军祥提出活动期UC中，湿热与瘀血贯穿疾病始终，同时伴有脾阳不足，应当治以清热燥湿、凉血化瘀、温中健脾，并创立了清肠温中方，这一理念的提出，也完全符合唐容川在《血证论》中提出的“止血、化瘀、宁血、补虚”的治血四法。

角蛋白以酸碱配对的形式构成上皮细胞骨架中间丝，在肠上皮中主要表达为K8、K9、K19和波形蛋白(VIM)，不仅与各种结肠直肠疾病的发病有关，并且在维持上皮完整性方面发挥重要作用[9]。K8是上皮细胞早期分化的标志,研究发现UC患者K8表达显著下调，可能导致UC患者肠道上皮层的分化受抑制,上皮层变薄而加重病情[10]。另有研究指出K8在急性期增加，当临床和内镜提示缓解时，其表达可有所恢复[11]。研究发现UC患者的病变组织中，巨噬细胞激活也可导致VIM分泌增多[12]。因此在与上皮剥蚀和隐窝萎缩的相关疾病中，潜在的细胞骨架表型可能会表现为VIM：K8比例逐渐上升。本研究发现，急性UC模型大鼠中VIM表达明显增多，K8表达明显低于空白组，VIM/K8比值显著增高，这与报道的变化规律相一致，经拆方各组分干预后，均能显著降低二者比值，且全方、温中健脾合清热燥湿和温中健脾合凉血化瘀组的作用更加明显。

IP10是内源性趋化因子，抑制IP10可以减轻IL-10-/-诱导的自发性结肠炎小鼠炎症程度[13]。研究发现UC患者的血清和结肠中IP10含量显著升高[14]；IP10 / CXCR3轴在儿童IBD的发病中，也起到重要作用[15]，因此提出，抑制IP10可能会缓解UC的临床症状。CXCR3是IP10的特异性结合蛋白，一旦与IP10结合后则被激活，并有助于其转移到炎症局部进一步发挥效应。而肠黏膜局部炎症产生的大量炎性细胞因子[16]，不仅能刺激IP10招募更多的炎症细胞形成级联反应，还能加重肠黏膜屏障的损伤。本研究发现拆方各组分(除凉血化瘀组)均能降低IP10和CXCR3在血清中的表达含量，凉血化瘀或清热燥湿组本身对降低CXCR3的效果相对较弱，但在联合了温中健脾治法后，就能明显发挥降低炎性介质的作用，发挥与全方相近的作用。

UC的出血和创面使血小板被大量激活，引起血小板黏附、聚集和高凝状态；同时由于血管收缩、微血栓形成，造成整体和局部低氧的微环境，肠屏障功能受损[17]。此外，炎症时局部血管通透性增强，更多的免疫细胞到达炎症部位，加重炎症部位的局部缺氧[18]。而在低氧环境下，HIF-1α的稳定性和转录活性都显著增加[19]，最终导致UC黏膜中的高水平表达。本研究发现，虽然各组间尚不存在统计学差异，但UC模型鼠的HIF-1α表达增高，经药物治疗后，表达均有所减低，且以清热燥湿合温中健脾、凉血化瘀合温中健脾及全方组的作用更为明显，联合组的药效明显优于单独应用温中健脾、清热燥湿或凉血化瘀。

《灵枢·百病始生篇》有云“邪不能独伤人……两虚相得，乃客其形”，强调了正气在发病中起的主导作用。当人体正气不足，或邪气的致病能力超过正气的抗病限度时，导致疾病的发生，即所谓的“邪之所凑，其气必虚”。扶正，就是通过药物或其他疗法扶助机体的正气，以增强体质，提高机体抗邪能力的一种治疗原则；祛邪，则是通过药物或其他疗法祛除或削弱病邪，减少邪气侵袭和损害，达到邪去正安的目的[20]。一方面扶正可以扶益本源，调动人体的抗病能力并直接起到祛邪之用，所谓“养正则邪自安”；另一方面祛邪有利于扶正，只有祛除了病邪，正气才可能迅速恢复，药力才可能直达病所，所谓“闭门留寇”就是祛邪不足而成的，“瘀血去而新血生”也佐证了“邪去正安”的道理[21]。扶正祛邪是中医治病的重要原则，二者是对立统一的，根据邪正消长及盛衰，决定治疗的主次，扶正不留邪，祛邪不伤正，才能达到阴平阳秘的治疗目标。

在本次拆方研究中发现，只采用清热燥湿或凉血化瘀的祛邪治法，无法对UC发挥满意的治疗效果，无法对其病理环节起到充分的调节作用，但清热燥湿或凉血化瘀在联合了温中健脾的扶正药物后，无论是从修复细胞骨架、减轻炎症、改善缺氧环境三个单独的环节，亦或是从整体来看，都能发挥与全方相当的治疗作用。因此也提示在溃疡性结肠炎的中医药治疗中，顾护正气、温中健脾是必不可缺的原则。