赵军 谢静华 李昕 师建平 常虹

女性卵巢功能在其绝经后减退致雌激素不足是公认的绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)病因，替代雌激素疗法(hstrogen replacement therapy，HRT)是治疗PMOP的首选疗法，其作用机制与强化骨密度(bone mineral density，BMD)和全身骨矿量有关[1-2]。鉴于女性长期服用传统雌激素药物所引起的严重不良反应，因此寻找一种平稳、安全、有效的治疗方法来替代雌激素药物对防治PMOP意义重大。基于课题组的前期研究，本实验通过观察蓝刺头对去卵巢大鼠BMD、血清DHEA、肾上腺CYP450的作用，研究蒙药蓝刺头通过调节雌激素转化酶、前体物质，经ER介导非经典途径防治PMOP的作用机制，为深入探讨蒙医“补暖补精—清镇赫依—固骨质壮骨”理论，以及PMOP的有效防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5月龄Wistar雌性大鼠56只，体重(280±30)g，购于内蒙古大学实验动物中心，合格证号：SCXK(蒙)2002-0001，饲养条件一致，大鼠适应性喂养7天后，开始复制去卵巢大鼠骨质疏松动物模型。

1.2 实验药品及试剂

蒙药蓝刺头制剂由广州中医药大学科技产业园有限公司提供；强骨胶囊由北京岐黄制药有限公司提供(规格：0.25 g/粒，30粒/瓶，批号：131204)；己烯雌酚片由合肥久联制药有限公司提供(规格：0.5 mg/片，批号：20181020)。

DHEA试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司(批号：201806213)；CYP450试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司(批号：201807584)；DAB显色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司(批号：1350345)；PBS缓冲液购自北京博奥森生物技术有限公司(批号：1346150607)。

1.3 实验分组及动物模型

大鼠适应性喂养7天后，将56只Wistar大鼠随机分为强骨胶囊组、蒙药蓝刺头低、中、高剂量组、假手术组、己烯雌酚组、模型组，共7组，每组8只。制备PMOP大鼠模型，10%水合氯醛溶液350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于鼠板；下腹部备皮-常规消毒-正中线2 cm开腹。腹腔底部找到宫颈-两侧子宫末端找到卵巢(注意子宫呈倒立“人”字形)-完全切除-回纳腹腔内容物-止血逐层缝合-消毒。假手术组术前准备同上，开腹后仅将卵巢从腹腔提出而不切除(仅切除卵巢周围少量脂肪组织)[3]。

1.4 造模成功的判定标准

依据文献[4-5]观察大鼠阴道涂片，确定造模是否成功，动物摘除卵巢后 5天，逐只进行阴道上皮角化实验检查，1 次/天，连续观察动情周期 5天，阴道涂片染色后显微镜下观察，均表现为动情间期(大量白细胞及少量上皮细胞) ，表示动物造模成功。56只PMOP动物模型全部造模成功。

1.5 药物制备及给药方法

造模成功大鼠饲养90天后开始给药灌胃。因大鼠体重均大于200 g，故蒙药蓝刺头低、中、高剂量组据人鼠体重比、人鼠代谢速率比计算后分别以27.500 mg/mL、13.750 mg/mL、6.875 mg/mL剂量灌胃给药，临床等效剂量以低剂量组为准，低、中、高剂量比为1∶2∶4；己烯雌酚灌胃剂量为0.0313 mg/mL，强骨胶囊灌胃剂量为23.4375 mg/mL，均是按成人有效剂量给药；假手术组、模型组灌胃等体积的生理盐水，为配药方便，按每日大鼠每1 g体重灌胃0.02 mL进行计算(因大鼠胃容积有限，因此每日灌胃在限定液体体积的情况下，考虑每日灌胃药量)。灌胃连续90天。

1.6 检测指标

(1)采用显微CT(Micro-CT)对所有大鼠右侧股骨近端干骺端BMD计量学指标进行分析；(2)大鼠血清脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)采用酶联免疫反应法测定；(3)行免疫组化染色法观察大鼠肾上腺CYP450的表达，每组大鼠取5张切片(n0)，每张切片随机选择5个视野(n1)，在光学显微镜下观察各组大鼠的染色情况(此实验由内蒙古医科大学分子生物学实验中心协助完成)。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 右侧股骨骨密度(BMD)计量学变化

模型组与假手术组相比差异显著(P<0.01)；蒙药蓝刺头中剂量组、假手术组、强骨胶囊组、己烯雌酚组与模型组相比差别明显(P<0.05)；蒙药蓝刺头高、低剂量组与模型组相比相比差别不明显(P>0.05)；蒙药蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组与蒙药蓝刺头高剂量组相比区别显著(P<0.05)；蒙药蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组组间比较无统计学差别(P>0.05)。见表1。

表1 各组去卵巢大鼠右侧股骨近端干骺端骨密度计量学结果比较

2.2 血清DHEA变化的比较

与假手术组相比，模型组血清DHEA水平显著降低(P<0.01)。同模型组比，用药以后蓝刺头中、高剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组的血清DHEA水平均显著升高(P<0.01)；蒙药蓝刺头低剂量组血清DHEA水平增加，但无明显差异(P>0.05)。与己烯雌酚组比，蓝刺头中、高剂量组血清DHEA水平升高，但差别均无统计学意义(P>0.05)。与强骨胶囊组比，蓝刺头中剂量组血清DHEA水平升高，蓝刺头低、高剂量组血清DHEA水平降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)。血清DHEA水平蓝刺头低、中、高剂量的组间比较均无统计学差异(P>0.05)。己烯雌酚组与强骨胶囊组相比，无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组去卵巢大鼠血清DHEA变化比较

2.3 肾上腺CYP450变化

由图1、表3可得出，与假手术组相比，模型组肾上腺CYP450的表达明显降低(P<0.01)。与模型组相比，蒙药蓝刺头中、高剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组肾上腺CYP450的表达均明显增多(P<0.01)；与模型组比，蓝刺头低剂量组肾上腺CYP450的表达明显增多(P<0.05)。与己烯雌酚组相比，强骨胶囊组、蓝刺头中剂量组肾上腺CYP450表达升高，蓝刺头低、高剂量组表达降低，差异均无统计学意义(P>0.05)。与强骨胶囊组相比，蓝刺头中剂量组肾上腺CYP450表达升高，己烯雌酚组、蓝刺头低、 高剂量组表达降低， 差异均无统计学意义(P>0.05)。蒙药蓝刺头中剂量组肾上腺CYP450的表达均高于蓝刺头低、高剂量组，且差异有统计学意义(P<0.05)，低、高剂量组间比较，差异不明显(P>0.05)。己烯雌酚组肾上腺CYP450表达比强骨胶囊组高，但差异不显著(P>0.05)。

注：A蓝刺头高剂量；B蓝刺头中剂量组；C蓝刺头低剂量组；D强骨胶囊组；E己烯雌酚组；F模型组；G 假手术组。

图1 各组去卵巢大鼠光镜下肾上腺CYP450结果观察(免疫组化×400)

表3 各组去卵巢大鼠肾上腺CYP450表达的情况比较

3 讨论

妇女围绝经期综合征免疫功能低下是因为免疫活性细胞获得不了雌激素生理剂量刺激，雌激素下降会导致体内DHEA浓度明显下降，引起神经—内分泌—免疫网络失调[6]。中医学认为，发生本病根本病机在于肾虚，尤其肾精亏虚，病位在肾、脾、肺。DHEA属雌雄激素的前体物质，是一种多功能的缓冲激素，对人体各个系统作用广泛[7-9]。CYP450主要作用将雄烯二酮和睾酮转化为雌酮、雌二醇(E2)[10-11]。正常骨代谢呈平衡动态，由成骨细胞介导骨形成与破骨细胞介导骨吸收相互偶联。绝经后妇女雌激素水平下降并逐步打破骨吸收与成骨的平衡，这是PMOP发病的主要原因[12]。蒙药蓝刺头作为常用接骨药之一，临床实践已证明，蓝刺头有壮骨、接骨愈伤的功效。蒙医在治疗骨折时惯用内服蒙药蓝刺头复方制剂、煎剂，疗效明显。植物雌激素(phytoestrogen，PE)活性物质具有弱雌激素样作用，可补充女性部分雌激素以减少绝经后骨量丢失，可作为替代传统雌激素的疗法，为PMOP的防治提供一种较有效、安全的新方法。蒙药蓝刺头可通过调节雌激素样作用，促进骨形成，调节成骨、骨吸收偶联，减少骨转换率，从而达到防治PMOP的目的[5，13-15]。

实验结果显示：与假手术组相比，模型组肾上腺CYP450的表达明显降低(P<0.01)。与模型组相比，蒙药蓝刺头中、低、高剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组肾上腺CYP450的表达均明显增多(P<0.05)。与己烯雌酚组相比，强骨胶囊组、蓝刺头中剂量组肾上腺CYP450表达升高，蓝刺头低、高剂量组表达降低，差异均无统计学意义(P>0.05)。得出结论，蓝刺头与西药、对照药作用相同，都可加强CYP450在肾上腺的表达；蒙药蓝刺头适当浓度具有增强CYP450肾上腺的表达作用；本研究从大鼠肾上腺角度说明蒙药蓝刺头具类雌激素样作用，对防治PMOP具有一定优势。

综上所述，在前期课题研究基础上，本研究通过观察蒙药蓝刺头对PMOP大鼠血清DHEA、BMD、肾上腺CYP450表达的作用，表明蒙药蓝刺头具有调节促进雌激素转化酶、前体物质高效表达作用，对PMOP大鼠OP治疗作用显著；防治PMOP通过调节雌激素介导非经典途径；同时，雌激素可促成骨细胞形成，进而防治PMOP。芳香化酶为雌激素形成的限速酶，其可减少局部组织的活性，并降低该组织雌激素水平，进而引起OP的发生，而人工干预芳香化酶表达依赖于深入研究其基因机制，从而有利于通过干预芳香化酶防治OP。当前需要对其机制进行进一步深入研究，以揭开其分子机制，为深入探讨中医“肾主骨”理论、防治PMOP提供一定的实验依据，并进一步指导临床。