杜秀云 赛米·赛麦提 赵新胜 李赞林 李义亮

前 言

非糜烂性反流病（non‑erosive reflux disease，NERD）是胃食管反流病（gastroesoghageal reflux disease，GERD）当中最常见的类型，在GERD的发病率中占约70%；且其发病率呈逐年上升趋势，严重影响患者的生活质量，并对公共卫生事业提出了严峻挑战[1‑3]。研究发现，NERD发病的重要病理生理机制与食管内脏高敏感（viceral hypersensitivity，VH）相关，且目前其治疗依赖于质子泵抑制剂。但对部分NERD患者反流症状疗效不佳，推测VH是NERD患者质子泵抑制剂疗效差的重要原因之一[4]。神经肽类物质如P物质（substance P，SP）和降钙素基因相关肽（calcitonin gene‑related peptide，CGRP）在NERD患者食管黏膜表达明显增加，且与疼痛感觉阈值呈明显负相关，推测SP和CGRP可能共同参与了NERD VH的外周机制[5]。

据研究报道，SP及白细胞介素‑6（Interleukin‑6，IL‑6）的释放有促炎性作用而使神经兴奋性增高引起感觉过敏，进而形成神经源性炎症，该现象被称为传人神经的传出功能，其可能是SP参与NERD食管VH性形成的重要机制之一[6]。近年来，研究神经肽与NERD VH的相互关系成为热点。本课题通过研究NERD患者和健康受试者食管粘膜层和血液中SP、CGRP的表达情况以及炎症因子表达及分布情况，探讨SP、CGRP以及炎症因子在NERD发生发展中的作用。

资料与方法

一、一般资料

收集2018年10月至2019年4月间在新疆维吾尔自治区人民医院住院就诊的NERD患者25例和健康受试者10例。所有研究对象中：男性22例（68%），女性13例（32%），正常对照组和NERD组年龄平均数分别为29.52岁和33.65岁。所有研究对象均进行GerdQ问卷调查、24 h食管pH监测、上消化道内镜等检查。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院住院伦理委员会批准，患者及家属对本研究的目的及意义均充分知情，且签署了知情同意书。

二、纳入与排除标准

1.纳入标准：（1）年龄18～65岁；（2）存在典型的胃食管反流症状，并至少持续3个月以上，或合并有食管外表现；（3）胃镜检查阴性；（4）质子泵抑制剂试验阳性；（5）知情同意者。

2.排除标准：（1）内镜下胃、十二指肠溃疡（无论活动期或静止期），糜烂性十二指肠炎；（2）内镜下消化道肿瘤；（3）有上消化道手术史；（4）知情不同意者。

三、检测指标

1.食道测酸：应用24 h食管pH监测GERD严重程度是应用电极检测患者24 h食管pH，远端电极置于食管下括约肌线上20 cm，近端电极置于食管下括约肌线上5 cm，测定患者24 h pH＜4的总百分时间（总酸暴露时间），pH＜4的次数（酸暴露频率），持续5 min以上的反流次数和最长反流时间，分析DeMeester评分，评价GERD严重程度。

2.食管测压：运用高分辨率食管测压分析食管下段括约肌（lower esopheagel sphincter，LES）长度、LES静息压、LES残余压、收缩前沿速度、食团内部压力及食管远端收缩积分等指标。

四、组织标本处理

要求各组患者签署知情同意文件，收集各组患者食管粘膜组织标本，置于-80℃冰箱备用。同步采集病人的清晨空腹血液3 ml，离心取血清，置于-20℃或-80℃冰箱备用。

五、组织病理学检查

食管组织标本4%中性甲醛固定24 h后水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋，制成5 μm厚切片行H&E染色。

六、定量反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription‑Polymerase Chain Reaction，RT‑PCR）

采用实时定量RT‑PCR方法检测SP、CGRP、白细胞介素‑1β（Interleukin‑6，IL‑1β）、IL‑6、干扰素‑α（Interferon‑α，IFN‑α）、及肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）的表达。每例组织标本置于TRIzol试剂（LIFE公司生产）提取总RNA，采用Fast Quant RT试剂盒（Foregene公司生产）合成第一链cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成引物，各指标及GAPDH引物序列和扩增产物长度见表1。RT‑PCR反应严格按照试剂盒操作说明进行。实时定量RT‑PCR，反应体系为20 μL，反应条件为95℃2 min，然后95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，共40循环。采用2—△△CT计算出各组目标基因的相对表达倍数。

表1 定量RT‑PCR引物序列及产物长度

七、统计分析

应用SPSS21.0软件进行数据处理。计量资料使用均数±标准差（±s）表示。两组间计量资料比较采用两独立样本t检验，两组间计数资料比较采用方差分析及χ2检验，相关分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为具有统计学意义。

结 果

一、本研究病例的一般情况

经过对研究对象的临床表现，GERDQ评分及内镜检查，研究对象分为NERD组和正常对照组。表2表示，性别、年龄以及体质量指数（Body mass index，BMI）等一般情况在两组间差异无统计学意义（χ2=1.232，P＞0.05）、（t=2.143，4.895；P＞0.05）。

表2 各组患者一般情况的比较

二、食管酸反流分析结果

如表3所示，食管24 h pH监测结果显示，NERD组患者弱酸反流（4＜pH＜7）次数、酸反流（pH≤4）次数、食管近端酸反流及DeMeester评分等指标明显高于对照组，两组间具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 两组GERD患者24 h食管酸反流的比较

三、高分辨率食管测压

食道高分辨率观测结果显示，NERD组和对照组食管下段括约肌LES长度、LES静息压、LES残余压、收缩前沿速度、食团内部压力及食管远端收缩积分等指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表4）。

表4 NERD组和对照组食管动力学比较

四、组织学特点

镜下观察发现，对照组粘膜组织形态基本完整，未见水肿或免疫细胞的浸润。NERD组食管黏膜可见中性粒细胞（以箭头所示）的浸润和炎症前反应（图1A）。组织炎症评分显示（图1B），NERD组食管粘膜的炎症损伤评分明显高于对照组，P值0.003，两组间具有统计学意义（P＜0.01）。

图1 两组食管粘膜组织H&E染色及炎症评分比较A示两组食管组织H&E染色（10×40）；B示两组食管炎症评分比较；**P＜0.01 vs对照组

五、食管粘膜SP和CGRP表达的结果

两组食管粘膜组织RT‑PCR实验结果显示，NERD组SP及CGRP的mRNA相对表达量与对照组相比显著上升，P值分别为0.0046，0.002，并具有统计学意义（P＜0.01）。

六、食管粘膜炎症因子

IL‑1β、IL‑6、IFN‑γ、TNF‑α等炎症因子指标的RT‑PCR实验结果显示，NERD组食管粘膜中，IL‑1β、IL‑6、IFN‑γ以及TNF‑α的mRNA相对表达量明显增高，P值分别为0.0034，0.0043，0.004，0.0028，两组间比较具有明显地统计学意义（P＜0.01）。

图2 两组食管粘膜组织SP及CGRP的mRNA表达**P＜0.01 vs对照组

七、相关性分析

通过Pearson相关性分析发现，NERD组酸反流评分（DeMeester）分别与SP、CGRP及炎症因子（IL‑1β、IL‑6、IFN‑γ、TNF‑α）的mRNA表达之间有强相关性，P值分别为0.003，0.000，0.002，0.005，0.004，0.000，具有统计学意义（P＜0.01），相关系数（r）分别为0.96、0.95、0.91、0.98。

图3 两食管粘膜组织炎症因子的mRNA表达**P＜0.01 vs对照组

讨 论

NERD患者典型的烧心、反流、胸痛症状和其内镜下观察食管黏膜病变阴性的特征，表明了在既往已知的GERD发病机制，如抗返流屏障功能降低、食管清除功能障碍、胃排空延迟之外另有他因[7]。近年来，随着对NERD研究的不断发展，VH在NERD发病机制中的作用逐渐被重视，被认为是可以解释产生烧心的病理生理机制和致使食管黏膜VH相关的神经肽（如SP、CGRP）也渐渐成为国内外研究的热点[8]。有研究证实，神经肽类物质SP、CGRP引起VH的过程中，食管黏膜中炎症因子出现了高表达的现象[9]。

GERD症状的产生除了与反流物的酸性程度及其量有关外，还可能与食管VH的产生有关。食管VH的产生机制尚不明确，可能与多种离子通道或相关受体表达的变化有关[10]。瞬时电位香草酸亚型1和蛋白酶激活受体2（Protease‑activated receptor，PAR‑2）作为两种重要的酸敏感受体，可能与食管VH的产生有关[11]。研究组的前期实验结果表明，不同亚型GERD患者食管组织中瞬时电位香草酸亚型1和PAR‑2阳性细胞表达均明显强于正常组，且其mRNA的表达水平在GERD组患者中呈高表达，并由瞬时电位香草酸亚型1和PAR‑2介导的VH产生机制中，PAR‑2可能处于主导作用[12‑15]。

研究发现，在功能性消化不良疾病的研究中提出CGRP和SP参与消化道VH发病机制[16]。CGRP和SP是食管痛觉产生及传导的两种重要物质，CGRP可以抑制与SP降解有关的内肽酶，使SP的作用增加或延长，两者在疼痛信息传递中可能存在协同作用[17]。高云等[18]通过测定NERD组及健康对照组血清CGRP和SP的含量并与GerdQ评分进行相关分析，发现NERD患者血清CGRP和SP表达水平明显高于正常对照组；且CGRP和SP表达与GerdQ评分呈正相关。因此，推测CGRP和SP可能在NERD VH的发病机制起重要作用。本研究，通过对NERD和正常组之间食管黏膜CGRP和SP含量对比分析的研究发现，NERD患者食管黏膜中CGRP和SP的含量和正常人组相比差异有统计学意义。因此，我们有理由推测CGRP和SP在食管黏膜中的过度表达可能和NERD患者VH有关。

CGRP和SP通过炎症反应参与到VH的过程中，食管黏膜末梢神经接受化学物质或机械扩张刺激后，CGRP和SP在食管黏膜中的过度表达，同时伴随着炎症因子的大量堆积，引起局部炎症反应[19]。有研究发现，NERD患者在食管黏膜中和血清中的炎症因子IL‑1β、IL‑6、IL‑8和TNF‑α水平、炎症密切相关的PAR‑2、环氧合酶‑2均明显高于正常人组[20]。本研究结果显示，与正常对照组相比，NERD患者食管下段粘膜组织中SP、CGRP及促炎因子（IL‑1β、IL‑6、IFN‑γ以及TNF‑α）的mRNA表达水平显著上升，并且与酸反流评分（DeMeester）存在正相关关系。这可能是酸反流可直接激活食管组织中神经肽类物质和炎症因子，从而引起VH和炎症的作用机制。至于神经肽物质、炎症因子、VH性之间的如何互相影响并最终导致NERD的发生发展，仍需要进一步实验研究加以证实。

综上所述，疼痛感觉的产生需要神经末梢感受器感受到相关物理或化学刺激产生神经信号，途径各级神经突触传导到大脑中枢神经处理相关刺激信号并作出疼痛感应。所有参与信号传导的各个环节均有可能影响NERD患者常见烧心的感觉。临床研究同样证实了NERD和焦虑之间有明显的关联，已经证明，焦虑和抑郁的程度越高，酸抑制疗法的效果越差，因此，心理因素可以用作抗返流治疗的预测指标。[39‑41]因此未来的相关研究需把精神因素考虑作为相关指标十分必要。NERD和精神疾病互为因果的关系商不得而知，但这些研究提醒我们中枢神经的异常亦有可能影响相关症状的产生，例如Martinez等研究提到的与反流无关的患者，其症状与胃酸反流无关，但与其它形式的反流或心理因素有关，约占NERD患者的32.0%。同样有研究指出，在大脑皮层层面或是脊髓神经亦或是周围末梢神经层面的病变，均有可能影响或引起内脏高敏感性。鉴于实验的伦理道德，目前绝大部分研究关注点都只在食管黏膜的病变，尚未有涉及从感受器传入神经再到中枢神经整条反应线路的研究，因此NERD发病机制的探索注定艰辛曲折。但即便是一小步的探索发现，亦有可能为众多对PPI治疗无效的NERD患者提供新的药物研发思路。本次研究可能具有重大的临床意义，在临床实践中我们应更加注意内脏高敏感性，尤其是对于酸抑制疗法反应较差的患者。此外，应研究新的NERD治疗方法，这些药物可以靶向刺激知觉链的每个组成部分，包括神经递质的新激动剂/拮抗剂，例如被SP激活的CGRP受体。能够降低超敏反应的药物可能具有治疗功能性疾病（如NERD）的潜力。