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胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一种以胃、十二指肠内容物反流入食管为特点，反酸、烧心、嗳气等症状为典型表现的常见消化系统疾病[1]。病因和发病机制尚不明确，可能与抗反流防御机制的削弱、食管黏膜屏障的完整性破坏及胃十二指肠内容物反流对食管黏膜的剌激有关。而最新研究证实，人类GERD的发生并不是反流物直接“酸蚀”的结果，而是通过刺激细胞因子调控的炎症反应，并最终引起食管损伤[2]。在此之前，一项动物试验研究也发现，反流性食管炎并不从食管粘膜表面的化学性损伤开始，而是从粘膜下层的淋巴细胞浸润开始，逐渐发展到粘膜表面的损伤[3]。体外培养试验也提示，轻度暴露于酸化的胆汁酸盐溶液中，对人类食管上皮细胞并无直接杀伤作用，而只是刺激其分泌炎症因子。在本课题组前期的组织学研究中也发现，GERD患者食管黏膜上皮均有不同程度的增厚，炎细胞数目增加明显，而且随着食管炎症加深，炎症因子白介素6（interleukin6，IL‑6）表达水平升高[4]。

程序性死亡因子配体1（Programmed death‑ligand 1，PD‑L1）是B7家族共刺激分子的一员，其在免疫炎性反应中发挥重要的负性调节作用，参与调节炎性细胞的功能和多种炎性细胞因子的分泌。而炎症因子能刺激引起PD‑L1的表达增高。故在本研究中，通过在体外建立食管上皮细胞与CD4+细胞共培养体系，用胃食管反流物（胆汁酸和胰酶的混合物）刺激诱导炎性细胞因子，观察PD‑L1的表达水平，探讨IL‑6、PD‑L1在胃食管反流病发生发展中的作用。

材料与方法

一、主要材料

SD大鼠购自湖北省疾控中心，6～8周；大鼠食管上皮细胞完全培养基、大鼠脾脏淋巴细胞完全培养基均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；CD4单克隆抗体、FITC均购自eBioscience；胎牛血清、青霉素‑链霉素均购自GIBCO；胰蛋白酶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹅去氧胆酸购自sigma公司；大鼠IL‑6 ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

二、食管上皮细胞的分离

取大鼠颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡5 min，移至超净工作台内，仰卧固定大鼠；剪开颈部、胸部皮肤，打开胸腔，取出食管，用显微镊剥离食管外层肌层，留取内层粘膜层组织，纵向剖开粘膜层，放入含双抗的PBS中，反复冲洗5次。将食管粘膜层放入离心管，加入消化液浸泡食管，37℃孵育，1 h；取出离心管，用吸管反复吹打组织，消化液经200目过滤，收集滤液，经100 g离心5 min，弃上清，保留细胞沉淀。

三、细胞培养方法

用大鼠食管上皮细胞完全培养基重悬细胞，接种于鼠尾胶原预先包被的培养皿中，于37℃，5%CO2恒温培养箱中静置培养，48 h后更换培养基，以后每3天换液1次。以免疫荧光CK‑18鉴定。

四、脾脏淋巴细胞的分离方法

大鼠脾脏研磨用200目筛网过筛后，1500 rpm离心5 min，细胞沉淀用红细胞裂解液裂解去除红细胞，获得的淋巴细胞用PBS重悬，用于后续检测。CD4+T细胞检测取分离后的细胞，计数；100 μl 0.5%牛血清白蛋白的PBS含重悬至1×106个待测细胞；2000 rpm离心3 min，弃上清液，100 μl PBS（含0.5%牛血清白蛋白）冲洗2次；待测管加入0.5 μg CD4抗体，4℃避光孵育30 min；2000 rpm离心3 min，弃上清液，100 μl PBS（含0.5%牛血清白蛋白）冲洗2次；以含0.5%牛血清白蛋白的0.5 ml PBS重悬后流式细胞仪检测分析。

五、细胞处理分组

A组为大鼠食管上皮细胞组，常规培养，无共培；B组为CD4+T细胞组，常规培养，无共培；C组为大鼠食管上皮细胞和CD4+T细胞共培养组；取处于对数生长期，生长状态良好的大鼠食管上皮细胞，以5×105个/孔接种于细胞培养6孔板中，分离得到的大鼠脾脏CD4+T细胞，以15×105个/孔接种于细胞培养6孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。三组细胞常规培养24 h，不予任何的刺激，测定其基础状态下IL‑6、PD‑L1的表达水平。三组先用鹅去氧胆酸（浓度为200 nmol/L）联合胰酶（活性为10 U/ml）共处理12 h后，再用盐酸溶液将培养基pH分别调节为4、5、6，培养12 h、24 h、48 h后分别收集下室细胞和上下室上清待测。

六、检测方法

1.IL‑6：采用ELISA法检测。OD值测定，应用FlexStation 3多功能酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度，绘制IL‑6的标准曲线，根据标准曲线，计算出IL‑6的浓度（pg/ml）。

2.PD‑L1：采用Western blot检测各组中PD‑L1的表达水平。取上述细胞悬液离心后弃上清液，37℃消化。取细胞悬液洗涤后裂解细胞，于4℃下12000 rpm离心5 min，取上清液用白蛋白含量检测试剂盒测定样品蛋白浓度。取上清液与上样缓冲液混合（体积比按照4:1混合）后100℃水浴10 min，室温冷却，每孔取40 μg样品上样，电泳，转印硝酸纤维素膜，封闭2 h。以α‑tubulin作为内参，加入一抗（稀释比例1∶2000）4℃孵育过夜，加入二抗（稀释比例1∶50000）室温摇床孵育2 h。ECL化学发光和与X线片定影。使用BandScan分析胶片灰度值，以PD‑L1与α‑tubulin灰度值比值表示PD‑L1的相对表达量。实验重复3次。

七、统计学分析方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。实验数据以±s表示。总体比较采用重复测量方差分析，对于满足球形检验数据无需校正，如需校正采用Greenhouse‑Geisser校正。以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

一、体外上皮细胞与CD4+细胞分离及共培养体系的建立

在体外建立上皮细胞与CD4+细胞共培养体系是研究免疫细胞对上皮细胞功能影响以及上皮细胞的免疫调节作用的一种有效手段。本研究成功分离出了大鼠上皮细胞及CD4+细胞，并成功建立了上皮细胞与CD4+细胞共培养体系。见图1和图2。

图1 免疫荧光鉴定食管上皮细胞（400X）

图2 流式细胞仪的鉴定结果，A：CD4+FITC，B：阴性对照1，C：阴性对照2

二、各细胞组中IL‑6的表达

食管上皮细胞组（A组），CD4+T细胞组（B组），及食管上皮细胞和CD4+T细胞共培体系组（C组）基础状态下（无任何处理，原代培养24 h），及用鹅去氧胆酸和胰酶等生物化学物质处理后，用ELISA法检测其IL‑6的表达水平。球性检验，χ2=3.046（P＞0.05），说明数据符合球形对称，不需进行校正。发现随着pH浓度的增加、培养时间的延长，IL‑6在各细胞中的表达量增高，其中IL‑6在C组的表达量最高，表明酸可能刺激免疫细胞增加IL‑6的表达。见表1和表2。

表1 IL‑6在不同处理条件的表达水平

表2 IL‑6重复测量方差分析结果

三、各组细胞中PD‑L1的表达

球性检验，χ2=75.857（P＜0.05），说明数据不符合球形对称，需进行校正，采用Greenhouse & Geisser方法进行校正后，整理重复测量资料的方差分析。随着pH浓度的增加、培养时间的延长，PD‑L1在各细胞中的表达量增高，其中PD‑L1在C组的表达量最高（见图3、表3‑4）。

表4 PD‑L1重复测量方差分析结果

讨 论

GERD是一种以胃、十二指肠内容物反流入食管为特点，反酸、烧心、嗳气等症状为典型表现的常见消化系统疾病[1]。当前，全世界约有10%～40%的成年人患有GERD。由于地域、人种、饮食等因素的差异性，GERD在世界范围内的发病率有所不同[5]。我国GERD患病率不仅存在性别差异、职业差异，还呈现西高东低的趋势，其中以新疆地区尤为显著，甚至有报道其患病率是我国其他地区的5倍之多，特别是维吾尔族中，该病患病率高达25%[6]。GERD的病因和发病机制尚不明确，可能与抗反流防御机制的削弱、食管黏膜屏障的完整性破坏及胃十二指肠内容物反流对食管黏膜的刺激有关。传统的观点认为是食管黏膜受到胃和十二指肠内容物包括食物、胃酸、消化酶等物质的刺激而出现的一系列改变，是由于食管上皮细胞受到化学性腐蚀作用而发生的性状改变[7]。在酸性条件下，反流出来的胃蛋白酶被活化，导致食管上皮表面的众多连接蛋白和细胞受到损伤。但最新研究发现胃酸、胃蛋白酶及胆汁酸盐等反流物并不能直接对食管构成损伤，而是通过刺激细胞因子调控的炎症反应，并最终引起食管损伤[2]。与此同时，随着越来越多的试验研究开始关注GERD患者体内相关细胞因子的变化，特别是炎症因子、白介素以及氧化应激反应与GERD的关系正日渐明朗。有研究显示，GERD暴露能导致正常食管上皮细胞中IL‑6、IL‑8和环氧化酶2的释放增加[8‑9]。其中，食管粘膜内白细胞介素1β（interleukin1β，IL‑1β）、白细胞介素8（interleukin8，IL‑8）、白细胞介素10（interleukin10，IL‑10）、IL‑6、血小板活化因子（Platelet Activating Factor，PAF）、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）等促炎细胞因子表达水平的增加被证实与GERD的发生发展密切相关[10‑11]。

在体外建立上皮细胞与CD4+细胞共培养体系是研究免疫细胞对上皮细胞功能影响以及上皮细胞免疫调节作用的一种有效手段。本研究中，发现单独培养的大鼠食管上皮细胞低剂量IL‑6，且大鼠食管上皮细胞+CD4+T细胞共培养后IL‑6的表达量更高，并且随着pH浓度的增加、培养时间的延长，IL‑6的表达量会更高，结果说明胃食管反流物能导致正常食管上皮细胞中IL‑6的释放增加，此与先前研究相符[8‑9]。同时说明，免疫细胞也影响上皮细胞，导致上皮细胞中炎症因子IL‑6分泌的增加。

炎症因子持续高表达可能引发食管病变，并造成GERD相关症状及并发症的出现。本研究发现大鼠食管上皮细胞+CD4+T细胞共培后，IL‑6表达量增高的同时，PD‑L1的表达水平也增加，说明炎症因子IL‑6可能诱导PD‑L1的表达。PD‑L1参与PD‑1/PD‑L1信号通路。PD‑1/PD‑L1是一条在免疫炎性反应阶段发挥重要作用的负性调节信号通路，参与调节炎性细胞的功能和多种细胞因子的分泌。一些常见的细胞因子如白细胞介素2、IL‑6、白细胞介素15等受体家族和干扰素都能增强PD‑1的表达，PD‑L1、PD‑L2和受体PD‑1结合后，趋化含SH2功能域磷酸酶1和2，通过去磷酸化削弱相应信号分子作用，抑制T细胞增殖活化并使其丧失免疫功能[12]。IL‑6 是 Janus激酶(JAK)/转录激活因子 3(STAT3)信号通路的重要的炎性因子，其传导也依赖于STAT3的参与。Wolfle等[13]研究发现刺激IL‑6的表达后可导致STAT3的表达上调，继而引起抗原提成细胞上的PD‑L1的表达，并且证实STAT3可结合在PD‑L1的启动子区域，从而调控PD‑L1的表达。此外，Loos等[14]采用免疫组织化学对101例Barrett食管癌中PD‑L1的表达进行检测，结果显示PD‑L1在Barrett食管肿瘤组织中表达，且与肿瘤TNM分期相关，肿瘤组织中表达PD‑L1的患者中位生存期是36个月，而不表达者中位生存期为136个月[15]。

综上所述，IL‑6、PD‑L1可能参与了由细胞因子调控的炎症反应机制最终引起食管损伤，因此减少局部T淋巴细胞浸润并控制相关细胞因子的分泌，可能通过阻止食管粘膜发生的一系列组织学变化，进而治愈GERD或延缓其进展。本研究只探讨了胃食管反流物对炎性反应的影响以及炎性环境对PD‑L1的表达水平的影响，后期将进一步研究细胞因子是如何通过信号通路影响PD‑L1的表达，以及它们之间的相互作用关系。