瓦热斯江·衣不拉音 吴振华 孙 伟 阿布力米提·阿布来提

肺腺癌因缺乏特异性诊断技术，加之早期无典型症状及表现，多数患者在确诊时已经发展至中晚期，失去最佳的手术机会，即便是接受手术治疗，根除率也较低[1]。目前，肺癌的发病机制不明确，多认为与职业暴露、特定的基因突变等因素有关[2-3]。可见为肺腺癌患者找到新的且疗效明确的治疗手段意义重大。当前已经发现的肺腺癌常见变异基因位点有鼠肉瘤病毒基因、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)等，其中EGFR基因突变的发生被认为是肺部恶性肿瘤发生与发展的主要遗传学因素[4-5]。但EGFR基因突变检查对技术、肿瘤组织获取、实验条件等均有较高的要求，目前可以展开基因检测的地区相对有限，开展难度大[6-7]。故找到一种可以早期评估肺腺癌患者EGFR基因突变情况的理想指标尤为关键。研究显示，胰岛素样生长因子-1受体(insulin like growth factor-1 receptor, IGF1R)在细胞生命活动中有着关键作用，参与了肿瘤细胞的生长与凋亡，在非小细胞肺癌组织样本中呈高表达[8-9]；Cezanne-1是一种有着去泛素化酶，与A20酶的序列相似，研究发现，其在肿瘤组织样本中呈过表达，且研究认为这种Cezanne-1过表达与增强EGFR信号通路作用及抑制EGFR降解有关[10-11]。故推测Cezanne-1表达与EGFR基因突变相关，但目前相关的研究并不多见。本文探讨IGF1R、Cezanne-1表达用于预测EGFR基因突变风险的价值，现报道如下。

资料与方法

一、临床资料

选择2017年3月至2019月4月医院收治的符合入选标准且得到明确肺腺癌肿瘤组织，并经病理科诊断明确为肺腺癌的患者56例，将其纳入研究组。其中男36例，女20例；年龄34～80岁，平均年龄53.11岁；吸烟者31例；病理分期：参照2009国际肺癌研究学会公布肺恶性肿瘤TNM分期(第7版)[12]，包括Ⅰ期3例，Ⅱ期13例，Ⅲ期29例，Ⅳ期11例。纳入同期在医院接受手术治疗并在术中获得病灶组织的51例肺部良性病变患者，将其作为对照组。其中男33例，女18例；年龄35～80岁，平均年龄50.27岁；吸烟者22例。全部纳入的患者均有明确的病理学结果，并获得病灶组织样本，病例组患者还获得少量癌旁组织样本；排除合并其他肿瘤疾病的患者、合并其他免疫性疾病的患者、合并其他器质性疾病的患者、合并其他重要脏器功能不全的患者。本项目的实施得到医院伦理委员会的批准，全部纳入的患者及其家属签署知情同意书。

二、研究方法

病理组织获得方法包括手术直接切除、纤支镜取得、CT辅助定位经皮肺穿刺取得。包括肺癌组织、癌旁组织、肺部良性病变组织。组织样本IGF1R、Cezanne-1、EGFR表达情况均采用免疫组化法测定。免疫组化切片、烤片等各个步骤使用的仪器均由Leica公司提供。具体免疫组化步骤：(1)标本的处理：固定、包埋、切片、捞片、烤片；(2)检测主要步骤：标本脱蜡、水化、抗原修复、一抗孵育、免疫组化试剂盒使用、显色、自来水冲洗、复染、脱水、透明、封片、读片。各指标阳性判读：经低倍镜、高倍镜观察并读片，由医院两名有自身免疫组化阅片经验的医师读片，在着色的病理组织中，高倍镜下至少5个各异的染色区域，按照细胞膜、细胞核或细胞质着色的程度来评价阳性细胞的百分率：着色细胞占比≤10%视为阴性，着色>10%则视为阳性表达(其中包括>10%～25%：弱阳性﹢；>25%～75%视为中等阳性﹢﹢；>75%视为强阳性﹢﹢﹢)。

EGFR基因突变检测：样本取样方法一致。该检测所用主要仪器与试剂由德国凯杰公司提供，包括EFGR基因突变检验试剂盒、荧光定量PCR仪等。取得组织样本之后使用福尔马林固定，石蜡包埋之后切片，离心制作并取DNA，进行荧光定量分析操作，各个操作步骤均需严格遵照试剂盒说明书进行。采用探针扩增阻滞突变系统(等位基因特异聚合酶链反应)检测，设置合适的反应条件，扩增后的产物使用荧光定量PCR仪器定量分析，主要的基因突变包括EGFR18、EGFR Exon19、EGFR Exon20、EGFR Exon21等基因突变情况。

三、统计学方法

应用SPSS20.0统计学软件处理数据，以百分比表示计数资料，用χ2检验或秩和检验进行组间比较，等级相关采用Spearman相关性检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、EGFR基因突变检出结果比较

肺腺癌组织EGFR基因突变阳性检出率高于癌旁组织及肺部良性病变组，差异有统计学意义(P<0.05)，癌旁组织与肺部良性组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组EGFR基因突变阳性检出率比较

二、研究组EGFR突变患者与未突变患者的临床特征比较结果

EGFR基因突变的肺腺癌患者与其他未检出基因突变的肺腺癌患者的性别、年龄、吸烟史、TNM分期等临床特征比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

三、IGF1R、Cezanne-1阳性表达检出率比较结果

肺腺癌组织检出IGF1R、Cezanne-1阳性率高于癌旁组织与肺部良性病变组织，差异有统计学意义(P<0.05)；癌旁组织与肺部良性疾病比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 IGF1R、Cezanne-1阳性表达检出率比较

四、不同EGFR基因突变组织中IGF1R、Cezanne-1阳性检出率比较结果

EGFR基因突变的肺腺癌组织中检出的IGF1R、Cezanne-1阳性率均高于未检出EGFR基因突变的组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同EGFR基因突变肺腺癌组织中IGF1R、Cezanne-1阳性检出率比较

五、肺腺癌组织中IGF1R、Cezanne-1表达与EGFR基因突变的相关性分析结果

经等级资料Spearman相关性检验结果显示，IGF1R、Cezanne-1表达与EGFR基因突变之间均呈正相关(r>0，P<0.05)，见表5。

讨 论

EGFR属于人类表皮生长因子受体(HER/erbB)家族，是一种蛋白脑氨酸激酶受体，主要由原癌基因c-erb-1编码表达，是跨膜糖蛋白受体的一种[12-13]。人类EGFR基因存在于七号染色体p13～q22之间，共5 460 bp，其中包含28个外显子，研究证实EGFR基因活化之后可以进一步启动转录系统，继而编码相关蛋白的表达，对细胞的异常增殖及分化产生直接刺激，是肿瘤发生与发展的决定性因子之一[14-15]。在非小细胞肺癌患者中，EGFR突变激活也可能是导致癌变的重要因素[16]。可考虑将突变结果的检出指导临床治疗。

本文结果显示，较癌旁组织与肺部良性组织，肺腺癌组织检出的EGFR基因突变率最高，为57%，较国外研究的30%～50%偏高，这可能与基因突变具有种族差异、人群差异等因素有关[17]；此外，因本文属于回顾分析，获得的病理组织切片可能并非新鲜的组织切片，长时间的保存，可能受其他因素影响，会导致检查结果出现偏差，还需要在未来进一步行前瞻性的研究加以证实并说明。且癌旁组织与肺部良性组织比较未见明显差异；同时对比了EGFR基因突变与未突变的肺腺癌患者的临床特征结果显示，二者间的临床特征比较均无明显差异，可见肿瘤分期、性别、年龄等并不会对肺腺癌患者的EGFR基因突变产生影响，将突变的结果用于指导治疗有一定价值。但需要注意的是，EGFR基因突变的检查对实验室、操作人员技术、仪器等均有较高要求，在国内仍有许多医疗机构无法满足该要求，故找到一种对肺癌患者EGFR基因突变有相对理想的预测价值的实验室指标，对间接预测肺癌患者EGFR基因突变、指导治疗有着关键意义，这也是现阶段临床研究的重难点。

既往，有研究采用血清学检查的方法，旨在找到可以准确预测肿瘤患者EGFR基因突变的血清学标志物，但大量的研究结果均表明了，血清学标志物的使用虽有一定预测价值，但因肺癌具有异质性，加之血清学受影响因素较多，故诊断的特异性不高[18-19]。IGF1R是受体脑氨酸激酶受体重要成员之一，也是IGF信号通路关键组成部分，研究证实，IGF在肿瘤细胞增殖与凋亡过程中起到关键作用[20-21]。随着临床对该受体在肿瘤疾病中的作用的不断深入研究，其相关的研究热点现已发展至IGF1R泛素化、去泛素化的动态平衡情况[22]。研究指出，IGF1R泛素化及去泛素化进程在肿瘤的生存、死亡中起到关键的调节效果，IGF1R的泛素化过程主要是对IGF1R受体内产生下调之效，这一调节过程与EGFR的泛素化动态平衡相关，此外EGFR还可以诱导泛素化降解[23-24]。故推测EGFR基因突变可能与IGF1R泛素化及去泛素化进程的改变有关。同泛素化作用相反，去泛素化酶主要经去泛素化来维持目标蛋白稳定[25]。Cezanne-1是一种主要在细胞信号通路信号传递期间起到决定性作用的主要去泛素化酶，作为去泛素化酶家族主要成员之一，其在细胞生命活动过程中起到具有决定意义的调节之效[26-27]。研究证实，Cezanne-1一旦缺失将造成HIF-1α泛素化过程改变，并经非蛋白酶体途径加速HIF-1α的降解[28]；此外，Cezanne-1还被证实可以对HIF-2α表达有调节之效，若细胞内Cezanne-1含量降低，细胞周期在进入到S期与M期这一过程便会发生异常[29]。Pareja等[30]在2012年的研究中采用RNA筛查的方法，发现了Cezanne-1与EGFR之间的联系，Cezanne-1是EGFR去泛素化酶，可以在信号通路内对受体的降解产生抑制来促进EGFR信号传递的增强。故推测，测定细胞组织内Cezanne-1表达可能对预测EGFR基因突变有一定价值。

本文结果显示，肺腺癌组织中IGF1R、Cezanne-1阳性表达率高于癌旁组织与肺部良性组织，且癌旁组织与肺部良性组织间比较未见差异，初步判断Cezanne-1与IGF1R在肺腺癌组织中表达的特异性。进一步分析肺腺癌组织中IGF1R、Cezanne-1阳性表达与EGFR基因突变的相关性结果显示，三者间两两呈正相关。由上述结果可以推测，IGF1R、Cezanne-1导致的EGFR基因突变可能与肺腺癌的发生发展有关。但因研究属于回顾性，且为了避免肺癌异质性带来的影响，本文仅纳入了肺腺癌，加之纳入的样本量相对较少，且国内外既往无较多的研究结果可作为循证支持依据，故结果与结论的真实性、可靠性均需要进一步在未来行大量的前瞻性、大样本、不同肺癌病理分型的实验研究加以证实。

综上所述，肺腺癌组织内IGF1R、Cezanne-1多呈过表达，EGFR基因突变率较其他正常组织高，且这种IGF1R、Cezanne-1的过表达与EGFR基因突变明显相关。