钱涛涛 施舜缤 朱 勇 张 林 王海龙

肺癌是当今世界对人类健康危害较大的恶性肿瘤疾病之一，其5年生存率仅为10%～15%，疾病的治疗效果与中位生存期均不尽如人意，故研究肺癌的发生发展相关机制对其合理治疗与预后有积极意义[1-4]。至今，肺癌的病因及发病机制仍未完全明确，传统观点认为疾病的发生、发展可能与家族遗传、吸烟、空气污染、电离辐射、职业致癌因子的活化及抑癌基因失活有关[5-6]。然而，随着研究的深入，越来越多的研究证实，在肺癌等恶性肿瘤发生发展期间，细胞免疫有着至关重要的作用[7-8]。辅助性T细胞17(helper T cell 17, Th17)是最近发现的新效应性CD4+细胞亚群的一种，分泌白细胞介素-17(interleukin-17, IL-17)是其主要临床特征，此外，Th17细胞还可分泌白细胞介素-21(interleukin-21, IL-21)等细胞因子，并在介导慢性炎症、防御胞外细菌感染、肿瘤及自身免疫性疾病等过程中发挥关键作用[9-10]。研究发现，IL-17能选择性上调肺癌患者部分血管源性因子，从而加速肿瘤新血管生成，增加肿瘤体内微血管数量与密度，推动肿瘤的生长、转移及浸润[11-12]。研究显示Th17细胞相关因子在恶性肿瘤疾病中表达，但其在肺癌不同分期中的表达鲜有报道。本文观察Th细胞相关因子在早期与晚期肺癌患者中的表达差异，分析其临床意义，以期为未来肺癌免疫研究提供参考依据，现报道如下。

资料与方法

一、研究对象

选择2016年2月至2019年2月收治的41例NSCLC患者作为研究组，其中男16例，女25例；年龄38～77岁，平均年龄(62.4±10.9)岁；体质量47～80 kg，平均(64.1±6.8)kg；受教育程度：14例小学及以下，16例初中或中专，11例高中及以上；组织学类型：腺癌29例，鳞癌12例；临床分期(参照2009年肺癌国际分期标准判定)[13]：Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。另选同期在我院接受常规体检的19例健康者作为对照组，其中男10例，女9例；年龄35～75岁，平均年龄(60.3±10.5)岁；体质量45～80 kg，平均(63.9±6.8)kg；受教育程度：8例小学及以下，6例初中或中专，5例高中及以上。入选标准：(1)研究组：经病理学或细胞学，并结合影像学检查结果证实为NSCLC患者；患者均为初次确诊；既往无化疗、放疗、手术及生物治疗史；(2)对照组：全部入组者相互之间无血缘关系，未合并支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等急慢性疾病，既往无类风湿性关节炎、多发性硬化症、肝炎病史等自身免疫性疾病，未合并其他恶性肿瘤疾病。研究组与对照组性别、年龄体质量、受教育程度等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。本项目获得院医学伦理委员会批准，全部入组受检者及其家属均知情，并签署知情同意书。

二、研究方法

1.Th17细胞因子检测：采集全部入选者空腹外周静脉血4 ml，并置于肝素钠抗凝管内，25 ℃室温下水平放置，8 h内实施流式细胞术检测前处理，同时使用干燥管采集外周静脉血3 ml，凝固后离心，取500 μl上清液置于EP管内，在-20 ℃条件下保存待检。

2.仪器与试剂：上海艾研生物科技有限公司提供的可调式移液器，科大创新股份有限公司提供的台式低速离心机，美国贝克曼公司提供的EXPO32 ADC流式细胞仪，中科美菱低温科技有限公司提供的低温冰箱，美国Satorus公司提供的电子天平，江苏金坛市医疗仪器厂提供的恒温水浴箱，上海跃进医疗器械厂提供的孵育箱，广州普阳医疗科技有限公司提供的肝素钠抗凝管，美国Corning Costar公司提供的24孔细胞培养板，北京天石天星科技有限公司提供的全自动酶免疫分析仪与全自动洗板机，青岛海尔公司提供的4 ℃冰箱。主要试剂包括莫能霉素、佛波酯、PE-抗人IL-17、PBS液，试剂均由美国Sigma公司提供。

3.Th17细胞检测：500 μl PBMC悬液，在标本内加入250×PMA/Ionomycin 2 μl和250×Monensin/BFA 2 μl，混匀；37 ℃、5% CO2培养箱培养5 h。每管加入100 μl刺激后，测定管加入10 μl CD3-PE-Cy5和10 μl CD8-FITC，4 ℃避光孵育30 min。加入FIX&PERM Reagent A 100 μl，室温孵育15 min；加入3 ml染色缓冲液，300 g离心5 min，弃上清收集细胞。涡旋，加入100 μl FIX&PERM Reagent B 100 μl，同时加入10 μl IL-17抗体，室温孵育20 min；加入3 ml染色缓冲液，300 g离心5 min，弃上清收集细胞。对应的对照管中加入同等μg数同型对照。加入5 ml PBS重悬细胞后上流式细胞仪检测。莫能霉素使淋巴细胞表面CD4抗原内陷，故以CD8-FITC反标，散点图中上左象限即为Th17细胞占淋巴细胞的比例。

4.Th-17细胞相关因子检测：使用酶联免疫吸附法检测NSCLC患者与健康对照组人群血清内IL-17表达及IL-21浓度，酶联免疫吸附试剂盒由美国R&D公司提供，IL-17最低检测限度为0.1 pg/ml，IL-21最低检测限度为1.0 pg/ml，检测期间所有操作均应按试剂盒严格进行。

三、统计学方法

结 果

一、两组外周血Th17细胞及其相关因子表达结果

研究组Th17细胞比例、IL-17水平、IL-21表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 研究组与健康对照组外周血Th17细胞及其相关因子表达比较

二、研究组Th17细胞及其相关因子与性别、年龄的结果

不同性别、不同年龄间NSCLC患者Th17细胞及其相关因子水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 研究组Th17细胞及其相关因子与性别、年龄的关系

三、不同病理分期NSCLC患者Th17细胞及其相关因子水平结果

随着肿瘤分期进展，NSCLC患者外周血Th17细胞比例，IL-17、IL-21表达均呈升高趋势，各分期间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同病理分期NSCLC患者Th17细胞及其相关因子水平比较

四、Th17细胞及其相关因子与肿瘤分期相关性结果

Th17细胞比例、IL-17、IL-21表达与NSCLC患者肿瘤分期呈正相关(r>0，P<0.05)，见表4。

表4 NSCLC患者Th17细胞及其相关因子与肿瘤分期相关性分析

讨 论

我国2014年肿瘤登记中心数据显示，肺癌患病人数为78.1万例次，其中有62.6万例因病死亡，在我国恶性肿瘤中居首位[14-15]。虽然放化疗、手术、靶向药物等恶性肿瘤疾病治疗技术在不断进步，但肺癌患者5年生存率仍较低，造成巨大的经济与社会负担[16-17]。肺癌的发生、发展与机体免疫平衡息息相关，在细胞免疫方面，主要是CD4+T淋巴细胞起到关键作用[18-19]。

NSCLC的发生发展与免疫功能状态有密切相关性，细胞免疫的效应细胞以T淋巴细胞为主，其中CD4+T淋巴细胞参与了机体免疫应答的各个阶段，是免疫调节不可或缺的关键环节[20-21]。Th17细胞是近年来最新发现CD4+T淋巴细胞的一种，在先天性免疫与获得性免疫中均有着至关重要的作用，分泌IL-17是其主要特点，分化成熟的Th17细胞参与了肿瘤的发生与发展，决定了疾病的转归及预后[22-23]。研究显示，相较于健康人群，NSCLC患者外周血内Th17细胞显著升高[24]。在NSCLC中以肺腺癌较多见，约为全部肺癌组织类型的43.3%[25]。但因本文主要观察Th17细胞相关因子在不同病理分期NSCLC中的表达及意义，故并未对不同病理类型NSCLC Th17细胞表达进行对比研究，还应在未来进一步研究。结果显示，较对照组，NSCLC组患者外周血Th17细胞比例、IL-17表达、IL-21表达均明显升高，这与范恒建等[26]研究结果基本一致，提示Th-17细胞也参与了NSCLC的发生与发展，IL-17、IL-21等Th-17细胞相关因子可能与肺癌的发病及病情进展有关。迄今为止，Th17细胞在NSCLC疾病发生发展中的作用仍有争议性，一方面肿瘤细胞内IL-17过度表达可加快新生血管生成及肿瘤的生长，此时若给予肺癌小鼠模型IL-17A注射及IL-17A阻断能够有效抑制肿瘤转移；另一方面，在肺癌小鼠模型被敲除IL-17基因后其转移情况更为明显[27-28]。

IL-17是能够促进血管内皮细胞迁移与内皮细胞形成的因子，同时该因子还能促进肿瘤内间质细胞与肿瘤细胞分泌出多种促血管生成细胞因子，如趋化因子、血管内皮生长因子等，加速肿瘤的转移、浸润与生长[29-30]。IL-21是Ⅰ型细胞因子，主要经活化CD4+T淋巴细胞、Th17细胞所分泌，与白细胞介素-4、白细胞介素-7等细胞因子拥有相同的γ链受体，其生物学功能广泛，参与获得性与天然的免疫反应，能够加速淋巴细胞的增殖，增强NK细胞与CD8+T淋巴细胞的细胞毒性作用，推动B细胞分化；该因子主要经Th17细胞所分泌，反过来还对Th17细胞起到调节之效[31-32]。为进一步明确Th17细胞相关因子表达与NSCLC病理分期的相关性，本文纳入我院近几年收治41例NSCLC患者，根据其病理分期结果检测并对比Th17细胞相关因子水平，结果显示，随着NSCLC病理分期增加，患者外周血Th17细胞比例、IL-17及IL-21水平表达呈上升趋势，说明Th17细胞相关因子水平变化可能与NSCLC的发生发展有关。进一步行相关性分析检验发现，Th17细胞比例、IL-17表达、IL-21表达与NSCLC病理分期呈正相关，也间接证实了Th17细胞相关因子在NSCLC中可能的指导价值。

综上所述，NSCLC患者外周血中Th17细胞呈高表达，且随病情的进展不断升高，检测NSCLC患者外周血Th17细胞及其相关因子水平，对病情的判断及了解患者机体免疫功能有重要的临床意义。