张容萍，李红芳，吴世洲，鲁富有，严达伟，陈培富

（1.云南农业大学，云南昆明 650201；2.普洱市动物疫病预防控制中心，云南普洱 665000；3.迪庆藏族自治州动物疫病预防控制中心，云南香格里拉 674499）

肠气泡病（pneumatosis cystoides intestine，PCI）又称肠壁囊状气肿病、肠气肿病[1]。在猪群中，这种病例非常少见，且通常只有宰后检验时才被发现。剖检可见猪空肠和回肠段，尤其是在肠管与肠系膜连接处，出现直径1～2 cm 的气泡；在肠管浆膜下发生的气泡多呈丛状，而发生于肠管和肠系膜连接处的气泡多形成葡萄串状[2]。指压气泡均有捻发音。该病除散发于猪外，在羊和鸡中也有报告。人也有类似疾病[3]，称为肠大泡性气肿（bullous emphysea of intestine）、囊肿性淋巴积气症（cystic lymphopneumatosis）、肠气肿（intestinal emphysema）、腹膜淋巴积气症（peritoneal lymphopneumatosis）等。国内人的类似疾病多见于儿童，婴儿通常表现腹泻症状，而成人基本不表现症状。近几年，发生于人结肠的肠管气囊肿症病例报道不断增多。

PCI 最早由日本池田义文和匈牙利胡体拉等学者于1980年发现和提出[1，4]，随后国内也陆续出现相关报道，但均只见于20 世纪80-90年代，且仅限于病理报告或组织形态描述，鲜有对其发病原因、致病机理等方面的研究报道。因不引起明显的临床症状，该病往往不被重视。国内外屠宰检疫人员认为，此病并不影响胴体合格率，将肠道弃之，其余部分仍可销售及食用。尽管如此，患病猪屠宰后仍会引起人们的感官不适以及对猪肉卫生状况的担忧。近年在云南省多地不同品种猪中均零星发现该病，其中在香格里拉市发现病例较多。为探讨其发病原因及致病机理，开展了织病理学观察与病原检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 样品采集自香格里拉市某藏猪场屠宰时发现有肠气泡病的4 头出栏商品猪，包括肝素抗凝血液和有肠气泡病变的小肠组织、肠系膜及其淋巴结，以及正常个体对照组织样品。宰前临床检查时，未发现正常猪和患病猪在体温、脉博、呼吸、精神、运动等方面存在明显差异，也未见饲料（玉米为主）霉变及脂肪肝情况。但饲养人员报告患病猪在仔猪阶段曾有腹泻经历，估计发病率约为5%。

1.1.2 主要试剂 病毒核酸提取试剂盒（TaKaRa Mini BEST 5.0 病毒RNA/DNA 提取商品化试剂盒）、逆转录试剂盒（TAKARA PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit），均购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖胶回收试剂盒（TIANgel Midi purification kit DP209-02），购自北京天根生化科技有限公司；基于胰蛋白酶大豆胨琼脂（TSA）的绵羊血琼脂，为自行配制；引物，由昆明擎科生物公司合成。根据猪瘟病毒（CSFV）E2基因[5]、猪流行性腹泻病毒（PEDV）ORF3基因[6]、传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因[7]和轮状病毒（RV）常见B 群VP6基因[8]，分别设计特异性引物（表1）。依据文献[9-12]的报道，合成细菌16S rRNA 通用引物和大肠杆菌腹泻相关毒力基因引物（表2）。

表1 病毒核酸引物序列

表2 细菌16SrRNA 基因和毒力基因核酸引物序列

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸检查 参照TaKaRa Mini BEST 5.0 病毒RNA/DNA 提取商品化试剂盒说明书，从组织样品研磨液中提取病毒RNA；使用TaKaRa PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit 进行逆转录反应。在冰盒上配置20 µL 反应体系：Primerscript Ⅱ RTase 1 µL，5×PrimerScript Ⅱ Buffer 4 µL，RNase Inhibitor 0.5 µL，dNTP Mixture 1 µL，oligo dT primer 1 µL，Ramdom 6 mers 1 µL，RNase free dH2O 9.5 µL，RNA 模板2 µL。反应条件：30 ℃10 min，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min。以cDNA 为模板，PCR 扩增病毒核酸，反应体系为：Mix 8.5 µL、ddH2O 8.5µL、上游引物0.5 µL、下游引物0.5 µL、DNA 模板2 µL。扩增程序为：95 ℃ 4 min 预变性，95 ℃ 40 s、53 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。

1.2.2 细菌分离鉴定 分别取20 µL 血液、少许气泡内壁刮取物、气泡根蒂组织及肠壁刮取物，涂布于血琼脂平板表面作有氧培养，涂布于添加半胱氨酸盐酸盐的血琼脂平板作无氧培养，37 ℃恒温箱培养24 h。将不同形态的菌落划线转种相应培养基继续培养1～2 代，直至形成菌落形态完全一致的纯培养物，再接种于麦康凯培养基或LB 液体培养基，培养过夜。取1 mL 细菌悬液与50%灭菌甘油等体积混匀，置于-80 ℃冰箱保存备用。将剩余菌液用于革兰染色镜检、生化发酵管培养及其他检查。生化试验包括，吲哚靛基质、甲基红（MR）、二乙酰（V-P）、三糖铁琼脂及其他糖发酵产酸产气试验。以细菌DNA 为模板，配制扩增16SrRNA基因的50 µL 体系：Mix 23 µL、上游引物1 µL、下游引物1 µL、DNA 模板2 µL、ddH2O 23 µL；PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 50 s，52 ℃45 s、72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 扩增结果。对PCR 产物作胶回收，经TA 克隆于pMD-18T，转化Trans T-1 大肠杆菌感受态细胞，从培养后的琼脂平板，随机挑选5～8个单菌落进行质粒DNA 测序，将所获序列使用DNAstar（5.0）软件进行分析并在NCBI 网站作BLAST 在线比对。毒力基因PCR 扩增体系（20 µL）：Mix 8 µL、上游引物1 µL、下游引物1 µL、模板DNA 2 µL、ddH2O 8 µL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min、退火（表2）1 min、70 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。玻片凝集试验：将被检菌液于121 ℃加热1 h，破坏其可能含有的K 抗原，取O 抗原10 µL 于玻片上，吸取10 µL 多价血清与之充分混匀，轻轻摇动玻片，于1 min 内肉眼判断结果，若出现凝集，再以单价血清作凝集试验。

1.2.3 病理学研究分析 将制作好的小肠及肠系膜石蜡组织切片做HE 染色，镜下观察组织细胞结构变化情况。

2 结果

2.1 病理剖检及镜检

肠气泡病猪剖检可见，轻症个体在空肠和回肠肠管外表浆膜下有多量突起的气泡，重症个体在空肠和回肠段肠系膜有大量直1 cm 以内的葡萄串状透明气泡，看似卵巢囊肿，有的在腹部脂肪组织也可看到类似气泡；戳破气泡，未闻到任何气味；气泡壁和肠管壁有淤血（图1），其余内脏器官无肉眼可见病变。

图1 肠气泡病猪剖检可见病变

光镜观察病理组织切片，可见患病猪肠管壁肌层和黏膜下层间充满大小不一的气泡，黏膜下层可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞增多（图2-a）；正常肠系膜结构呈规则网状结构排列，其间分布少量嗜酸性粒细胞，病变肠系膜网状结构紊乱（图2-b）；肠系膜细胞淤血，脂肪细胞体积增大，结缔组织有大量炎性细胞渗出，见聚集的多核巨噬细胞、上皮样细胞，组织间隙较大，结缔组织增生，成纤维细胞和嗜酸性粒细胞增多，产生以慢性增生为主的炎症病变（图2-c）；小肠肠腺体积增大，杯状细胞增多、体积明显增大（图2-d）；肠系膜淋巴结巨噬细胞增多（图2-e）。

图2 组织切片形态学观察结果

2.2 病毒核酸检测

从5 份肠道上皮组织及白细胞提取核酸样品，进行CSFVE2基因、TGEVN基因、PEDVORF3基因及RVVP6基因的PCR 扩增检测，结果都为阴性。

2.3 细菌检查

患病猪血液、气泡根蒂组织及气泡内壁在血琼脂平板上均未见细菌生长；4 份病样和1 份正常样品的肠壁刮取物在血琼脂平板上，有氧和无氧条件下均为形态特征一致、光滑湿润的乳白色单一菌落。生化试验发现，分离菌株符合大肠杆菌特性。PCR 扩增16SrRNA 获得与目的片段预期大小相符的产物（图3）。TA 克隆经测序分析证实，分离菌株为大肠杆菌。随机挑取5个独立菌落作PCR扩增，未检出致病性大肠杆菌常见的9种毒力基因。菌液也未与O157、H7、O104、H4 阳性血清发生肉眼可见的凝集现象，表明不属于这些常见的致病性大肠杆菌血清型。

图3 分离菌株16S rRNA 基因的PCR 扩增结果

3 分析与讨论

该养猪场地处香格里拉市一座海拔约2 500 m的山坡上，昼夜温差通常达10 ℃以上，距离县城约100 km，与外界接触甚少。据该养猪场养殖人员介绍，肠气泡病的发病率为5%左右，冬季检出率较高，且患有肠气泡病的猪在仔猪阶段常有腹泻经历。本研究挑选仔猪阶段有腹泻经历的8 头出栏猪进行屠宰取样，检出4 头患肠气泡病，病变部位主要在空肠和回肠段肠系膜，其中1 头在腹部脂肪组织也观察到气泡病变，进一步检查未发现常见猪腹泻相关病毒，仅从肠壁刮取物中分离到不属于O157、H7、O104 或H4 血清群，且无常见致病基因的大肠杆菌。

猪肠气泡病是一类气体代谢异常疾病，其发生机制尚不清楚。国外学者曾用致病性大肠杆菌感染无菌猪，得到的悉生猪在大肠肠壁出现气泡囊肿，而其他内脏器官均表现正常[13]，由此提出细菌学说。本研究发现，从肠气泡病猪中分离到的大肠杆菌并非常见致病血清型，且病变部位主要在小肠及其肠系膜，但不能排除大肠杆菌分离株可能存在其他或未知的毒力成分。本研究发现，肠腺及杯状细胞体积明显增大，这可能是患病个体小肠发生代偿性分泌肠液（黏液）的组织形态表现，提示腹泻相关因素对小肠产生了某种代谢压力。值得一提的是，根据2017年英国科学家加尔文·科菲提出的观点，肠系膜是一个连续但独立的器官，而非肠道组织的附属物[14]，其功能及病理意义尚不清楚，因此全面阐明肠气泡病的发生机制可能需要从全新角度去考虑。

就本研究而言，基于大肠杆菌能分解乳糖、产生乳酸和氢气的生化特性，推测可能由于当地昼夜温差大，引起仔猪出现较大的胃肠冷热应激反应，从而一方面造成仔猪腹泻，另一方面形成利于肠内大肠杆菌生长的条件。大肠杆菌在肠道内厌氧分解饲料中的糖类，而产生大量不能被机体组织利用的氢气，在肠内形成较大的氢气压力。氢气经中央乳糜管吸收后游离进入小肠浆膜层，因其组织结构致密程度不一，从而形成大小不一的葡萄串状气泡，最终表现为肠气泡病。本研究发现1 例病猪在其腹部脂肪组织也有气泡形成，推测这可能是在特定压力下，气体在体内扩散的结果。本试验未检测到大肠杆菌分离株有致病性，提示猪肠气泡病基本不影响猪的生长发育，这与观察到的实际情况一致。组织病理学观察肠系膜及其淋巴结，发现嗜酸性粒细胞和巨噬细胞略有增多，提示肠气泡病会伴发轻度炎症。值得注意的是，尽管吉林、辽宁等平原地区[4，15]也有检出该病的报道，但香格里拉市海拔较高，血氧分压相对较低，这可能是肠气泡病的一个促发因素，以致该地发生猪肠气泡病的比例高于云南其他地区。按照类似设想，有学者指出吸氧疗法是早期祛除人肠管气囊肿症的有效疗法[16]，但在猪中，如何防治肠气泡病仍是一个需要继续研究的课题。