王六合，王 涛，刘文伟，张 震

（1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐 830063；2.新疆农业大学，新疆乌鲁木齐 830091）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是正黏病毒科的RNA 病毒，根据病毒粒子表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，分为不同亚型，目前发现有18种HA 亚型和11种NA亚型[1]，其中H1—H16、N1—N9 各亚型流感病毒均可在禽类中分离到[2]。禽流感对养禽业危害极大，因而被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病，其中高致病性禽流感被我国列为一类动物疫病[3]。AIV 不仅血清型较多，而且毒株容易变异[4]，其中高致病性AIV 还具有蔓延速度快、致死率高等特点。AIV 也会感染人。研究发现，大多数人感染病例都有活禽接触史或去过活禽交易市场，而且活禽市场环境中有较高的病毒阳性率。目前认为活禽交易、屠宰、加工等涉禽场所是人感染的主要地点。对这些地点进行合理消毒是切断禽流感传播途径的一种有效方法。因此，为了解新疆乌鲁木齐市活禽交易市场AIV 污染状况，开展了活禽档口、活禽屠宰点以及活禽运输车辆三大主要环节的AIV核酸检测，以期为降低活禽交易市场禽源流感向外界传播的风险，指导活禽市场清洗消毒提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 柱式RNA 核酸提取试剂盒（批号YRNA-TQ 20190926P）、AIV 通用型荧光定量RT-PCR 检测试剂盒（批号AIV20191018P），哈尔滨元亨生物药业有限公司提供；H5、H7 和H9亚型AIV 三重荧光定量RT-PCR 检测试剂盒（批号60050），深圳澳东检验检测有限公司提供。

1.1.2 主要仪器 高速冷冻离心机（型号3K15），购自德国Sigma 公司；实时荧光定量PCR仪（型号QuantStudio 5），购自美国赛默飞公司；瞬时离心机（型号MinX-5），购自美国ABI 公司。

1.1.3 样本 每个活禽档口，采集地面、墙面（高于地面约0.8 m）、笼具、采食槽、污水及粪便的棉拭子；每辆活禽运输车，采集轮胎、车厢、笼具及驾驶室棉拭子；每个活禽屠宰点，采集脱毛机、接血槽、刀具案板、污水及地面棉拭子。将采集后的样本放在装有冰袋的采样箱内送至实验室。共在该活禽交易市场的49个活禽档口、16 辆活禽运输车和23个活禽屠宰点，采集473 份棉拭子样本。

1.2 方法

1.2.1 样品灭活 将采集的棉拭子样品放入恒温水浴锅中，56 ℃ 30 min 灭活。

1.2.2 AIV 核酸提取 将水浴锅中的棉拭子样品取出后，置于振荡器充分震荡，然后8 000 r/min，离心2 min；取100 mL 上清液至1.5 mL 灭菌离心管中，参照柱式RNA 核酸提取试剂盒说明书提取AIV RNA，并将提取后的核酸-20 ℃保存待检测。

1.2.3 AIV 核酸检测 将提取的RNA 核酸，参照AIV 通用型荧光定量RT-PCR 检测剂盒说明书进行检测。

1.2.4 AIV 核酸分型 将检测为阳性的核酸，参照H5、H7 和H9 亚型三重荧光定量RT-PCR 检测试剂盒说明书进行分型，对阴性样品定义为未分型。

2 结果与分析

2.1 AIV 核酸检测

2.1.1 基本情况 473 份棉拭子样本中，检出AIV 核酸阳性115 份，阳性检出率为24.31%。其中：活禽屠宰点阳性25 份，阳性检出率为21.74%；活禽档口71 份，阳性检出率为24.15%；活禽运输车19 份，阳性检出率为29.69%。

2.1.2 活禽档口 在6种棉拭子样品中，均有阳性样品被检出，其中污水和笼具样品的阳性检出率较高，分别为44.90%和34.69%，墙面和地面较低，分别为12.24%和10.20%（表1），说明活禽档口AIV 污染较广，而污水和笼具是活禽档口最严重的AIV 污染源。RT-PCR 检测结果见图1。

表1 活禽档口棉拭子AIV 核酸检测结果

图1 活禽档口棉拭子AIV 核酸荧光RT-PCR 检测结果

2.1.3 活禽运输车 在4种棉拭子样品中均检出AIV 阳性，其中运输车辆车厢内装活禽的笼具污染最严重，阳性检出率为56.25%，轮胎中的阳性检出率最低，为12.50%（表2），说明活禽运输车辆的AIV 污染较严重，其中笼具是运输车辆污染的最重要环节。RT-PCR 检测结果见图2。

表2 活禽运输车棉拭子AIV 核酸检测结果

2.1.4 活禽屠宰点 在5种棉拭子样品中，除地面未检出阳性外，其余4种均检出阳性，其中脱毛机和接血槽阳性检出率较高，分别为47.8%和34.78%（表3），说明活禽屠宰点的屠宰工具或用具最易污染AIV。RT-PCR 检测结果见图3。

图2 活禽运输车棉拭子AIV 核酸荧光RT-PCR 检测结果

表3 活禽屠宰点棉拭子AIV 核酸检测结果

图3 活禽屠宰点棉拭子AIV 核酸荧光RT-PCR 检测结果

2.2 AIV 核酸分型

115 份AIV 核酸阳性样品，经H5、H7 和H9亚型三重荧光定量RT-PCR 检测，检出H5 亚型26份，阳性检出率为22.6%，H9 亚型45 份，阳性检出率为39.13%，未定型44 份，阳性检出率为38.26%，未检出H7 亚型（表4），说明活禽市场H9 亚型AIV 污染最严重，也存在一定比例的H5亚型病毒污染。H5 和H7 亚型AIV 核酸荧光RTPCR 检测结果分别见图4 和图5。

表4 不同类型样本的AIV 核酸分型情况比较

图4 H5 亚型AIV 核酸荧光RT-PCR 检测结果

3 讨论

2014年7 月新疆报告首例人H7N9 流感病例，加之乌鲁木齐作为新疆地区的首府城市，是最大的活禽集散、交易、流通地，又有3 条候鸟迁徙路径途径乌鲁木齐市，因此高致病性禽流感给本地区人民的生命财产安全造成极大威胁。为了便于集中统一监督管理，乌鲁木齐市将原3个活禽交易市场搬迁集中至该活禽市场。从该活禽交易市场3个主要环节来看，活禽运输车（29.7%）、活禽档口（24.15%）、活禽屠宰点（21.74%）都存在AIV 污染，而且污染都较为严重。从我国其他省市活禽交易市场的检测结果来看，广东省广州市活禽交易市场AIV 核酸群阳性率为49.21%，广东省东莞市阳性率为11.05%，安徽省惠州市阳性率为22.14%，2014—2017年云南省保山市阳性率为2.50%～68.18%。这些均充分说明活禽交易市场散播AIV 的风险较高。

活禽档口内的污水、笼具、粪便阳性检出率较高，与闭福银等[6]、薛娜等[7]的相关报道一致，说明这些是活禽市场禽流感防控消毒工作的关键点。活禽档口内的污水污染状况很大程度上跟内部的排水系统有关。据调查，该市场内22个档口的下水道均有不同程度的堵塞，且冲洗笼具、地面等污水未经严格消毒直接排出。因此，应尽快改善交易市场活禽档口内的排水系统，尽可能保障污水能及时排出。由于从事活禽交易职业人群的自我防范意识差[8]，且活禽交易市场人员密集、流动性强，已成为人感染AIV 的最危险场所，因此应该加强对活禽交易职业人群的禽流感知识培训，提高其自我防护意识。

活禽运输车装载活禽的笼具阳性检出率高达56.25%，是活禽运输环节的关键消毒点。冬季室外温度较低，活禽排泄物容易结冰，更易导致冲洗消毒不彻底，这可能是笼具阳性检出率较高的主要原因。有4 辆车的驾驶室检出阳性，说明驾驶员的流动也会造成病毒传播。调查发现，该活禽交易市场内的活禽大多不是本地饲养而是由外地运输而来的，提示应该做好运输检疫，对进入活禽交易市场内的活禽运输车辆严格把关，要经产地检疫认可、抽样检疫认可、工具消毒认可后，才能三点连一线，开检疫证明，验证放行[9]。要做好入场消毒，这是避免疫病凭借交通运输工具传播蔓延的有效方法。

活禽屠宰点的脱毛机、接血槽阳性检出率较高，是市场活禽屠宰点禽流感防控消毒工作的关键点。调查发现，屠宰点对屠宰工具的消毒并不全面彻底，只把消毒重心放到了地面消毒上。虽然一般情况下AIV 跨种传播能力较低[10]，但仍存在感染人的风险，尤其是有交易市场活禽接触史和暴露史的人群[11-12]。目前认为，活禽屠宰加工点、交易市场等涉禽场所是人感染AIV 的高风险地点[13-14]。

各亚型阳性率比较发现，H9 亚型阳性检出率较高（39.13%）。这可能与市场内水禽数量较多而且种类复杂有关。调查显示，该市场每日鸭子、鹅及鹌鹑的交易数量占交易活禽总数的10%。建议该活禽交易市场尽量将交易水禽集中至固定档口，与陆禽分开。该市场也存在一定比例的H5 亚型病毒污染（22.6%），提示活禽养殖户应在养殖环节进一步加强H5 亚型的防控工作。

此次调查是在冬季开展的，因此只掌握了冬季该活禽交易市场AIV 污染状况和分布特点，计划后期在春、夏及秋季持续开展调查，以充分了解活禽交易市场全年的AIV 污染分布状况，从而科学有效指导交易市场开展消毒工作。

4 结论

调查发现，该活禽交易市场AIV 污染较为严重，活禽运输车、活禽档口和活禽屠宰点均有污染，其中活禽档口中的污水、笼具、粪便，活禽屠宰点的脱毛机、接血槽，以及活禽运输车的装载笼具为AIV 传播的关键风险点，应特别注意加强消毒。