胡蓓蓓 李雪微 白海 贾婉萍 梁永强

邻面去釉(interproximal reduction,IPR)是正畸医师常用的一项临床操作，通过磨除少量牙冠邻面釉质来获得矫治间隙，从而达到矫治的目的[1]。随着3D重建技术，计算机辅助工程技术的发展，新型无托槽隐形矫治器成为了正畸医生和患者们的新宠。隐形矫治技术中，轻度至中度牙列拥挤，牙齿形态、大小异常及Bolton比不调均考虑设计邻面去釉操作[2]。而有学者[3-4]研究认为牙釉质厚度具有一定规律，邻面去釉广泛使用的同时也存在着一定的风险，牙齿在邻面去釉后患龋的风险增加。本文旨在制备出一种新型防龋再矿化材料CPP-nHAP溶液，筛选出其对正畸邻面去釉后釉质表面防龋作用的最佳浓度，希望能为临床提供一种新型的防龋再矿化材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酪蛋白磷酸多肽粉末(和光纯药工业株式会社，日本)；纳米羟基磷灰石粉末(20 nm,北京髙德威金属科技开发有限责任公司)；抽滤器(DHP-360，昆明玻璃仪器有限公司)；电磁力搅拌器(JB50-SH，上海标本模型厂)；超声振荡仪(DL-1000D，上海之信仪器有限公司)；傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR，Vector-33，Bruker公司，德国)；多乐氟(高露洁棕榄有限公司，德国)；HVST-1000ZA显微硬度仪(上海敏新检测仪器有限公司)；电子游标卡尺(YB5001B，卡夫威尔有限公司)；硬组织切片机(E310CP，德国EXAKT)；恒温水浴箱(常州智博仪器)；HDGC-9533BT型pH测定仪(北京华电仪器有限公司)；扫描电镜(S-4800型，日本日立公司)；人工唾液配方：0.4 g氯化钠、0.4 g氯化钾、0.795 g无水氯化钙、0.78 g硫化钠、0.005 g磷酸二氢钠和1 g尿素，用去离子水稀释至1 L，pH调至7.0；人工脱矿液配方：0.52 g硝酸钙，0.30 g磷酸二氢钾，3.00 g冰醋酸，用去离子水稀释至1 L，pH 4.5。

1.2 不同浓度CPP-nHAP溶液的制备

称取1、3、5 mg的CPP粉末溶于纯水中，磁力搅拌器充分溶解，得到100 ml浓度为1%、3%、5%的CPP溶液，再将11.11 g nHAP粉末溶于各浓度的CPP溶液中，使nHA的质量分数为10%，37 ℃水浴锅内充分搅拌混匀，加入氢氧化钠使溶液pH为8.0，再超声震荡3 次，使纳米颗粒充分散开，得到浓度为1%、3%、5%的CPP-nHAP悬浊液(图1)。可观察到1%、3%、5%CPP-nHAP溶液流动性依次减小，均为乳白色悬浊液，其中5%的流动性最小，摇动离心管会出现溶质贴壁现象。

1.3 CPP-nHAP溶液防龋实验

1.3.1 离体牙收集 收集新鲜完整、釉质发育良好的前磨牙50 颗，检查是否有龋坏，是否存在色素沉着，脱矿的白垩色；是否经过牙冠及牙髓治疗。检查完毕后将50 颗牙齿纳入研究。酒精反复擦拭，放入生理盐水中，4 ℃保存,实验所用牙齿均经过患者本人同意。

图1 各组溶液性状Fig 1 The solution properties of the groups

1.3.2 离体牙制备与分组 石膏固定50 颗标本牙，暴露牙冠，邻面进行均匀去釉、抛光，游标卡尺测量最终去釉厚度为0.3 mm，相同方法处理牙冠两侧。去釉后金刚砂轮沿牙轴方向切开，分成100 个标本，用抗酸指甲油封闭形成去釉小窗口，随机分为5 组,每组20 个标本。A组：不做任何处理，去离子水冲洗，2 次/d；B组：在去釉小窗口上均匀涂布多乐氟，干燥形成黄色薄膜，仅使用1 次，去离子水冲洗备用；C组：将标本置于1%CPP-nHAP悬浊液中浸泡5 min，2 次/d；D组：将标本置于3%CPP-nHAP悬浊液中浸泡5 min,2 次/d；E组：将标本置于 5%CPP-nHAP悬浊液中浸泡5 min，2 次/d。再根据测量方法将各组分为2 个小组，分别用于显微硬度测量、扫描电镜和能谱分析，每小组10 个标本。

1.3.3 体外pH循环 各组处理后的邻面去釉标本进行体外pH循环，在37 ℃恒温水浴箱中，上午8 时按分组进行再矿化处理5 min，11 时将标本浸泡于人工脱矿液中2 h，下午6 时继续进行再矿化处理5 min，其余时间标本均置于人工唾液中，此为完成一次循环。标本每次换液前用大量去离子水冲洗，每日更换人工唾液和人工脱矿液，循环30 d。

1.4 主要检测指标

1.4.1 溶液性状观察 取浓度为1%、3%、5%的CPP-nHAP、10%nHAP、CPP溶液置于无菌试管中，共5 个无菌试管，静置24 h后观察其性状变化。

1.4.2 傅立叶变换红外光谱扫描 3 组不同浓度的CPP-nHAP溶液抽滤冷冻干燥得到3 组固体粉末，将3 组固体粉末和nHA粉末各取1 mg，加入100 mg KBr研磨压片，在傅里叶红外光谱仪上进行4 000～400 cm-1波数扫描。

1.4.3 显微硬度测量 用显微硬度仪测量实验前后牙釉质的显微维氏硬度，载荷50 g，持续15 s，标本开窗区随机测三点，求平均值。

1.4.4 扫描电镜观察及釉质表面元素分析 将实验后的标本固定于载物台上集中进行真空喷金处理，放入扫描电镜真空室内观察去釉表面形态，放大2 000 倍进行图像采集。并用能谱仪分析釉质表面元素，计算钙磷质量比。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0进行数据分析，组间均数比较釆用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 溶液性状观察

静置24 h后，10%nHAP悬浮液出现分层现象，大量HAP小颗粒沉淀于离心管底部。1%、3%、5%CPP-nHAP组仍为乳白色悬浊液，管底有少量颗粒沉淀，其中1%组沉淀物比3%、5%组多(图1)。

2.2 傅立叶变换红外光谱分析

图2 nHAP、CPP、CPP-nHAP红外光谱图Fig 2 FT-IR patterns of nHAP,CPP and CPP-nHAP

2.3 显微硬度测量

防龋实验后各邻面去釉样本的显微硬度值及其差值见表1。由单因素方差分析可得出实验前后标本的显微硬度值差值有显著性差异(P<0.05)，防龋制剂均在防龋实验中产生了效果。防龋实验前各标本之间显微硬度值无显著差异(P>0.05)，实验结束后各标本之间的显微硬度值有显著性差异(P<0.05)，说明不同防龋再矿化剂对去釉后牙釉质的防龋效果影响各不相同。LSD-t检验进行组间两两比较后，实验后浓度为1%的CPP-nHAP组与多乐氟组显微硬度值无显著性差异(P>0.05)，3%CPP-nHAP组硬度最大，而空白组的硬度最小。

表1 样本处理前后各组显微硬度测量值Tab 1 The MH values of the samples before and after treatment of the groups (n=10,

2.4 扫描电镜观察

对各组标本实验后的釉质表面进行电镜观察(图3)，空白组釉质表面粗糙不平，可见脱矿留下大小不一的低密度凹坑。多乐氟组可见有片状物质不均匀沉积在孔隙表面，1%组釉质表面粗糙，有大小不一的脱矿孔隙，可见颗粒状的矿物质沉积，有的孔隙内可见片层状晶体沉积。3%组釉质表面的脱矿孔隙减少，可见表面形成不规则的矿化物沉积层。5%组釉质表面脱矿孔隙减少，可见矿物质部分沉积形成的沉积层，但较3%组矿化层不均匀。

图3 5 组釉质表面形态(SEM,×2 000)Fig 3 The surface morphology of permanent enamel of the samples of the 5 groups(SEM,×2 000)

2.5 釉质表面钙、磷比值

X线能谱分析显示(表2)，实验后5 组间釉质面钙磷比值有显著性差异(P<0.05)，具有统计学意义。两两比较可得出，1%、3%、5%组CPP-nHA组和多乐氟组钙磷比值均大于空白组(P<0.05),3%组和5%组钙磷比值无差异(P>0.05)，均大于其他各组(P<0.05)。

表2 样本处理后各组釉质面所含的钙磷比值Tab 2 The calcium and phosphorus ratio of the samples of 5 groups after treatment (n=10,

3 讨 论

邻面去釉是通过去除少量邻面釉质使牙齿形态大小发生改变，来纠正患者牙齿比例不协调，轻中度牙列拥挤。随着隐形矫治技术的流行，邻面去釉技术的使用频率大大增加。但邻面釉质机械磨除后，会增加领面釉质的粗糙程度，使菌斑堆积残留，釉质变薄，牙齿抗酸能力下降，去釉后的牙面的易患龋风险提高。邻面去釉后防龋是不可忽视的问题，氟化物是目前使用最广泛的一种，多数学者[5-6]认为氟化物能增强釉质抗酸能力，促进釉质再矿化，还有研究认为[7]氟化物中的氟离子与菌斑竞争钙离子结合，减少菌斑的形成。姚博文等[8]研究发现氟化物处理后的牙面再次酸蚀仍能发现大量的片层状矿化物沉积，氟化物能稳定的与牙釉质结合不易脱落。刘奕等[9]根据显微硬度值，氟含量析出值评估多乐氟的再矿化能力优于5%氟化钠溶液。虽然氟化物在防龋上取得了优良的效果，但有学者认为[10]，过量氟使用会导致氟中毒，儿童时期氟斑牙，耐氟菌株出现等不良副作用。

CPP-ACP是在中性和碱性环境下，从牛奶中提取的具有生物活性的载体物质(CPP)，与牛奶中提取的不定型磷酸钙(ACP)结合形成的复合物质[11]。CPP作为矿物质的载体，结合易被牙齿吸收的磷酸根离子和钙离子，减少釉质脱矿。Vyavhare等[12]体外防龋实验认为，氟化物的防龋效果优于CPP-ACP糊剂，酪蛋白磷酸肽可以作为辅助手段联合氟化物使用。纳米羟基磷灰石(nHAP)与传统的羟基磷灰石晶体结构不同，具有更强的生物活性.吸附性和溶解性[13-14]。刘成霞等[15]研究发现，粒径20 nm的nHAP再矿化效果最佳，20 nm的nHAP可以牢固的吸附在釉质表面，提高釉质表面抗酸能力，减少釉质脱矿,但有学者认为[16]小粒径的nHAP因其表面能高、纳米结构的量子尺寸效应发生团聚，会影响再矿化作用。吕奎龙等[17]通过体外实验证实nHAP对牙齿表面具有再矿化能力，经nHAP处理后，牙齿硬度明显增大。Huang等[18]实验比较证明nHAP促进早期釉质龋再矿化的最佳浓度为10%。

CPP作为矿物质载体，将nHAP加入不同浓度的CPP溶液中对nHAP改性，形成CPP-nHAP复合物，减少nHAP团聚作用。CPP-nHAP的FI-IR显示均出现了nHAP和CPPs的综合特征峰，O-H键，磷酸根，酰胺带伸缩振动产生的吸收峰，考虑是 nHAP与CPPs不只发生了简单的机械结合，还形成了化学键发生了化学作用，形成了性能稳定的复合材料。但关于浓度为3%CPP-nHAP特征峰偏移和强度的变化，考虑与二者内部结合方式有关，需进一步探讨。nHAP组发生小颗粒聚集沉淀，溶液分层，而CPP-nHAP静置24 h后，未发生颗粒沉淀，仍为性状稳定的乳白色悬浊液，考虑一方面是CPP为粘性强的胶体溶液，nHAP均匀散布沉积在胶体溶液中，增强了nHAP的稳定性；另一方面是CPP与nHAP发生了化学反应形成了一种新的化学物质，CPP-nHAP复合物是一种乳白色悬浊液。在本实验研究之初，课题组成员设定了1%、2%、3%、4%、5% 5 个浓度梯度，预实验后结果显示防龋效果1%组和2%组无统计学差异，3%和4%组无统计学差异，最终因此本着最低浓度的原则选取了1%、3%、5%进行了实验比较。

Magalhaes等[19]认为多乐氟产品是美国FDA治疗和预防龋病的金标准，本实验选取多乐氟为阳性对照，通过体外防龋模拟实验，采用扫描电镜观察釉质表面再矿化情况，X线能谱仪、显微硬度仪测量邻面去釉表面实验前后钙磷比，显微硬度，用于评价再矿化剂的防龋效果。浓度为1%、3%、5%的CPP-nHAP在邻面去釉后均能起到抑制釉质脱矿，防龋再矿化作用，浓度为1%的CPP-nHAP与多乐氟效果相当，而浓度为3%、5%的CPP-nHAP防龋效果均优于多乐氟，其中浓度为3%的CPP-nHAP溶液防龋效果最佳，为临床防龋方面的应用提供一定的参考价值和理论依据。