杜暘 金鼎 高秀秋

牙体牙髓病在人类口腔疾病中比较常见，由于龋病等因素导致牙髓产生炎症，会引起患牙的剧烈疼痛并导致功能障碍，给患者带来极度的不适，影响生活质量[1]。但是，有关牙髓炎症损伤修复的分子机制目前尚不明确，需进一步探索。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能够引起牙髓组织发生炎症反应，从而抑制牙髓细胞的增殖、分化等[2]。Toll样受体 (Toll-likereceptors，TLRs)能识别LPS，是LPS作用受体之一，促进炎症因子释放，激活炎症相关靶基因的表达[3]。核转录因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)以非活性的p65/p50/NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB-α，IκB-α)三聚体复合物形式存在于细胞质中[4]，可以被多种因素激活，包括LPS和理化因素(X射线、氧化剂及化疗药物制剂)等[5]。在炎症疾病系统中转录因子NF-κB起着关键的作用[6]，当炎症发生时，炎症细胞因子大量释放，如白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)等[7]。TLR4/NF-κB信号通路是否参与了LPS诱导的人牙髓细胞(human dental pulp cells，HDPCs)细胞炎症目前暂无统一结论，并且开发能够拮抗LPS诱导牙髓组织炎症的天然药物是迫切解决的问题。

紫草素，又名紫草醌，是植物紫草(Lithospermiun erythrorhizon Sieb.et Zucc)中的一种有效成分，具有较强的抗炎作用[8]。研究发现[9-10]，紫草素能抑制炎性反应和促炎因子的释放，促进巨噬细胞免疫负调控抑制因子白细胞介素-10(IL-10)的表达。紫草素的抗炎机制可能与TLR4和NF-κB的p65亚基磷酸化有关[11-12]，但具体的分子机制还未发现。本实验研究紫草素对LPS诱导HDPCs细胞炎症的影响，初步探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

紫草素(Enzo Biochem，美国)；DMEM低糖培养基、I型胶原酶、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、PBS(Gibco，美国)；脂多糖(LPS)、甲基噻唑基四唑(MTT)(Sigma-Aldrich，美国)；Human IL-1β Platinum Elisa、Human IL-6 Platinum Elisa、Human TNF-alpha Platinum Elisa、Human IL-10 Platinum Elisa(eBioscience，美国)；裂解液、SDS-PAGE配胶试剂盒、BCA蛋白试剂盒(北京康为世纪生物公司)；TLR4、p-NF-κB、β-actin抗体(Cell Signaling，美国)。

1.2 HDPCs体外培养[13]

经患者知情同意后，收集锦州医科大学附属第二医院口腔科门诊就诊的患者，由于正畸或者阻生而拔除的完整并且健康的牙齿。在无菌条件下超净台中，取出牙髓组织，用PBS反复清洗3 次，剪成小块，直径约为0.5 cm，放入含3 mg/ml的I型胶原酶的EP管中，在培养箱中消化30 min，在1 000 r/min条件下，离心5 min，然后弃上清液，加入适量含20% FBS的低糖DMEM原代培养液，然后将组织块转移在25 cm2培养瓶中，倒置于5% CO2、37 ℃、相对湿度为100%的恒温培养箱中培养，6～8 h后翻瓶，在显微镜下观察细胞是否贴壁，细胞贴壁后，每3 d换液1 次。细胞长至80%时，用0.25%消化胰酶进行消化，1∶2比例进行传代培养。

1.3 MTT法检测紫草素和LPS对HDPCs的细胞毒性

取对数生长期的HDPCs(5×104个/ml)接种于96 孔板中，每孔200 μl，培养24 h，细胞长至70%～80%，吸弃孔内培养基，加入100 μl用DMEM培养基稀释含不同药物浓度的培养液(紫草素终浓度为0、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L；LPS终浓度为0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/ml)，培养24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。吸弃孔中液体，每孔加入150 μl DMSO，摇床上晃动10 min，用多功能酶标仪(Biotek，美国)490 nm测取吸光度，同时设置对照孔，每组设6 个复孔。

1.4 紫草素对LPS诱导的HDPCs炎症模型细胞存活率的影响

将HDPCs分为4 组，正常对照组(DMEM培养基)、模型组组(培养基中LPS浓度为1 μg/ml)、紫草素低剂量组(培养基中LPS浓度为1 μg/ml+25 μmol/L紫草素)和紫草素低剂量组(培养基中LPS浓度为1 μg/ml+50 μmol/L紫草素)。取对数生长期的HDPCs(5×104个/ml)接种于96 孔板中，每孔200 μl，培养24 h，细胞长至70%～80%，吸弃孔内培养基，按照上述分组进行给药，培养24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。吸弃孔中液体，每孔加入150 μl DMSO，摇床上晃动10 min，于490 nm处进行吸光度检测，同时设置对照孔，每组设6 个复孔，测定紫草素对HDPCs细胞存活率的影响。

1.5 ELISA检测细胞培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量

取对数生长期的HDPCs(1×106个/ml)，接种于6 孔板中，按照“1.4”中实验分组分别加入不同受试物，培养24 h后，收集HDPCs上清液，12 000 r/min离心10 min，吸取上清至EP管中，按照ELISA试剂盒步骤测定IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。

1.6 Western blot法检测蛋白水平

取对数生长期的HDPCs(1×106个/ml)，接种于6 孔板中，按照“1.4”中实验分组分别加入不同受试物，在培养箱中培养24 h后，吸弃孔中培养基，用PBS轻轻洗涤2 次，每孔中加入60 μl裂解液，放在冰浴裂解20 min，12 000 r/min离心10 min，获得总蛋白样品。BCA法测定蛋白浓度定量后，在蛋白样品中加入适量SDS-PAGE蛋白缓冲液，金属浴变性沸腾10 min。上样量为40 μg，经电泳分离后，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗抗体TLR4、p-NF-κB和β-actin(β-actin作为内参蛋白)，4 ℃过夜，TBS-T洗膜4 次，每次5 min，然后加入对应的荧光二抗，室温避光孵育2 h，TBS-T洗膜4 次，每次5 min，显影和扫描使用荧光影像分析仪(LI-COR，USA)。ImageJ 1.41 软件(Bethesda，美国)进行数据分析。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 紫草素和LPS对HDPCs细胞毒性的影响

如图1所示，在不同浓度的紫草素和LPS的处理下，HDPCs被药物作用24 h，在0～400 μmol/L浓度范围内，紫草素对HDPCs基本没有细胞毒性，浓度超过400 μmol/L时细胞存活率显著降低。在不同浓度梯度的LPS处理下，结果表明，在0～0.25 μg/ml给药浓度范围内，没有产生细胞毒性，当浓度是1 μg/ml时，细胞存活率显著降低(P<0.01)，说明此浓度的LPS对HDPCs产生细胞损伤，成功建立细胞炎症模型。

图1 紫草素和LPS对HDPCs细胞毒性 Fig 1 The cytotoxicity of shikonin and LPS on HDPCs n=6)

2.2 紫草素对LPS诱导的HDPCs细胞炎症模型细胞存活率的影响

如图2A所示，与正常组相比，模型组细胞存活率显著降低(P<0.01)，说明LPS对HDPCs造成炎症损伤；与模型组相比，在紫草素的作用下，细胞存活率显著升高(P<0.05)，为剂量依赖性，说明紫草素可以减少LPS引起的炎症损伤，提高细胞存活率。

2.3 紫草素对LPS诱导的HDPCs中IL-1β水平的影响

如图2B所示，与正常组相比，模型组IL-1β水平明显升高(P<0.01)，说明LPS能够刺激IL-1β细胞炎症因子的释放，引发炎症反应；与模型组相比，给药组中的IL-1β水平显著降低(P<0.01)，并且存在剂量依赖性，说明紫草素能对抗LPS引起的细胞炎症，抑制促炎因子IL-1β的释放。

2.4 紫草素对LPS诱导的HDPCs中IL-6水平的影响

如图2C所示，与正常组相比，模型组IL-6水平明显升高(P<0.01)，说明LPS能够刺激IL-6细胞炎症因子的释放，引发炎症反应；与模型组相比，给药组中的IL-6水平显著降低(P<0.05)，并且存在剂量依赖性，说明紫草素能对抗LPS引起的细胞炎症，抑制促炎因子IL-6的释放。

2.5 紫草素对LPS诱导的HDPCs中TNF-α水平的影响

如图2D所示，与正常组相比，模型组TNF-α水平明显升高(P<0.01)，说明LPS能够刺激TNF-α细胞炎症因子的释放，引发炎症反应；与模型组相比，给药组中的TNF-α水平显著降低(P<0.01)，并且存在剂量依赖性，说明紫草素能对抗LPS引起的细胞炎症，抑制促炎因子TNF-α的释放。

2.6 紫草素对LPS诱导的HDPCs中IL-10水平的影响

如图2E所示，与正常组相比，模型组IL-10水平显著降低(P<0.01)，说明LPS抑制IL-10的释放；与模型组相比，给药组IL-10水平显著升高(P<0.05)，呈现剂量依赖性，说明紫草素能够提高抑炎因子IL-10的释放，抑制LPS引起的细胞炎症，具有一定的抗炎作用，并且高浓度的紫草素炎症的缓解作用较低浓度的紫草素强。

2.7 紫草素对LPS诱导的HDPCs中TLR4蛋白表达的影响

如图3所示，蛋白印记结果表明，与正常组相比，模型组中TLR4蛋白表达显著升高(P<0.01)，说明LPS能够使TLR4蛋白表达升高，发生炎症反应，引起HDPCs炎症损伤；与模型组相比，给药组中TLR4表达显著降低(P<0.01)，并且呈剂量依赖性，说明紫草素能够降低LPS引起的细胞炎症，降低TLR4蛋白的表达，具有明显的抗炎作用，并且高剂量紫草素组的作用效果强于低剂量组紫草素组。

2.8 紫草素对LPS诱导的HDPCs中p-NF-κB蛋白表达的影响

如图3所示，与正常组相比，模型组中p-NF-κB蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，给药组中p-NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.01)，并且呈剂量依赖性，说明紫草素能够降低LPS引起的炎症，降低p-NF-κB蛋白的表达，具有明显的抗炎作用。

3 讨 论

牙髓是牙髓腔内疏松的结缔组织，具有重要的生理功能，如形成牙本质、营养、感觉、修复等，HDPCs则是牙髓组织中重要的细胞器[14]。LPS作为革兰阴性菌细胞壁的成分之一，能够诱导促炎细胞因子在牙髓组织中发生免疫应答[15]，引起牙髓病和龋病[16]，LPS诱导疾病机制可能是通过激活TLR4分子及其下游的NF-κB和MAPK信号通路蛋白的表达[17]，增加炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，抑制IL-10的分泌[18]，然而紫草素具有很强的抗炎作用[19]，能够抵抗LPS导致的炎症反应[20]。

A：各组细胞炎症模型细胞存活率；B：IL-1β分泌水平；C：IL-6分泌水平;D:TNF-α分泌水平;E:IL-10分泌水平图2 紫草素对LPS诱导的HDPCs细胞存活率，IL-1β，IL-6，TNF-α，IL-10分泌的影响 A：The viability of HDPCs of the groups;B:The release level of IL-1β;C:The release level of IL-6;D:The release level of TNF-α;E:The release level of IL-10Fig 2 The effects of shikonin on LPS-induced HDPCs cell survival and the secretion of IL-1β,IL-6,TNF-α and IL-10 n=6)

A：TLR4蛋白表达；B：p-NF-κB蛋白表达图3 紫草素对LPS诱导的HDPCs中TLR4及p-NF-κB蛋白表达的影响 A:TLR4 protein expression;B:p-NF-κB protein expressionFig 3 The effects of shikonin on the expression of TLR4 and p-NF-κB in HDPSs induced by LPS n=3)

本研究结果表明紫草素能够升高由LPS诱导的HDPCs细胞存活率的降低，诱导细胞毒性，引起细胞损伤。在LPS的刺激下，IL-1β、IL-6和TNF-α细胞促炎症因子的表达显著升高，IL-10抑炎因子水平显著降低；TLR4/NF-κB信号通路被激活，TLR4和p-NF-κB蛋白表达显著升高。在紫草素的治疗下，炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低，IL-10抑炎因子水平显著升高，说明紫草素能够抑制LPS引起的细胞炎症，降低促炎因子的释放，提高抑炎因子的分泌，并且存在剂量依赖性；而且紫草素能够抑制LPS引起的TLR4/NF-κB信号通路的激活，降低TLR4和p-NF-κB蛋白的表达，由此说明紫草素具有很强的抗炎作用，其作用机制可能是通过调节TLR4/NF-κB信号通路来抑制LPS引起的炎症反应，这将为牙髓病的治疗提供新思路和新靶点，有利于开发治疗牙髓病且毒副作用小的天然新药。