岳增文 王树斌 刘进忠

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),是口腔颌面头颈部常见的恶性肿瘤，近年来发病率有上升的趋势，目前在口腔癌中的比例已超过90%[1]。OSCC严重威胁着人们的健康，而明确其发病机制，有针对性采取预防和干预措施，一直是研究人员努力的方向。

前期研究中发现大肿瘤抑制因子2(large tumor suppressor homolog 2,LATS2)基因在口腔鳞癌组织中的表达明显低于正常口腔黏膜组织，且LATS2启动子区域的高度甲基化与其低表达明显相关[2-3]。通过过表达LATS2基因后口腔鳞癌细胞的增殖显著受到抑制，且促凋亡蛋白Bcl表达明显上调，细胞凋亡增加。先前的研究发现LATS2在肿瘤发展和细胞周期调控中起重要作用，并且可通过下调抗凋亡蛋白Bcl家族表达，以及诱导前凋亡蛋白Bax、p53和caspase3等方式促进细胞凋亡[4-5]。在细胞生理过程中，自噬、凋亡、程序性坏死都是细胞死亡形式，它们相互影响、相互调节，自噬可能在此过程中扮演重要的角色。本研究通过在口腔鳞癌细胞中过表达LATS2来观察其对OSCC细胞自噬功能的影响，以探讨其在OSCC发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

人口腔鳞癌细胞株SCC-25(ATCC,美国典型培养物收藏中心)；慢病毒转染LATS2于SCC-25的稳定细胞系已成功构建，该病毒载体无GFP荧光标签。细胞于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内常规孵育。DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(Gibco公司,美国)；PBS、青霉素和链霉素(Hyclone公司,美国)；抗LATS2多克隆抗体、抗Beclin-1抗体(Abcam公司,美国)；抗LC3B抗体(Cell signaing公司,美国)；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) 多克隆抗体(上海威奥生物技术公司)；H-800型透射电镜(日立,日本)；荧光检测仪、Leica SP8共聚焦显微镜(Leica公司,德国)；Western印迹荧光检测增强化学发光(ECL)系统(Azure公司,美国)。对照组分为Control组、Lenti-control组，实验组为Lenti-LATS2组。

1.2 Western印迹

提取转染72 h后各组细胞，BCA法测量蛋白浓度，取40 μg蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜。于含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1 h，加入一抗后，4 ℃封闭过夜。TBST洗膜3 遍，分别加入二抗IgG稀释成1∶5 000，室温避光孵育2 h。TBST洗膜后，ECL法显色蛋白条带，然后进行凝胶成像分析，共3 次平行实验。

1.3 共聚焦显微镜检测自噬流

本研究采用双腺病毒mRFP-GFP-LC3转染已稳定表达LTAS2的SCC-25细胞。该系统中LC3携带有红色荧光的mRFP和绿色荧光GFP，并可聚集在自噬前体和自噬体膜上，使其在荧光显微镜的红绿合成图像中呈黄色亮点；由于LC3携带的GFP绿色荧光在自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，所形成的酸性条件使GFP荧光淬灭，而mRFP红色荧光耐受降解，使自噬溶酶体呈红色亮点。据此可用来判断自噬情况。为此，将MOI值为100的阴性对照腺病毒及mRFP-GFP-LC3双标腺病毒加入培养液中，培养8 h后进行半量换液；72 h后置于激光共聚焦显微镜下进行拍照。

1.4 透射电镜观察细胞超微结构

各组细胞以2×105/ml的密度接种于细胞培养瓶中，培养72 h后用细胞刮收集细胞，用不完全DMEM/F12培养液洗涤，离心沉淀后加入2.5%戊二醛固定2 h。PBS洗3 次，再用4 ℃预冷的1%锇酸固定1 h，脱水后包埋，70 nm厚超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，应用透射电镜进行观察并拍照。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 LATS2对自噬相关蛋白变化的影响

Western印迹结果显示，与空载体对照组和阴性对照组相比较，过表达 LATS2 的SCC-25细胞的LC3、Beclin-1蛋白表达水平显著高于空载体组和阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1 过表达LATS2的SCC-25细胞中自噬相关蛋白的表达(*P<0.05，**P<0.01)Fig 1 The expression of autophagy-related proteins in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 免疫荧光检测

LATS2基因在SCC-25细胞稳定过表达后，SCC-25细胞经双荧光mRFP-GFP-LC3自噬流系统检测自噬过程，即可见自噬体(黄色斑点)和自噬溶酶体(红斑点色)数量有显著增多，而对照组只有极弱而少的荧光斑点(P<0.05)(图2)。

2.3 细胞超微结构观察

与空载体对照组(Control)和阴性对照组(Lenti-control)相比，过表达 LATS2后，电镜下SCC-25细胞质内出现自噬体和(或)自噬溶酶体的数量明显增多(P<0.05)(图3)。

3 讨 论

自噬是一种非凋亡形式的程序性死亡方式，广泛存在于真核细胞的病理生理过程中。当细胞亚细胞膜结构发生动态变化后，其溶酶体发动对细胞内蛋白质和细胞器降解的过程，并形成自噬体降解其底物。近年来随着对自噬研究的不断深入，其在肿瘤发生、发展中的作用引起更多人的重视。自噬在肿瘤发展中具有促进和抑制的双重作用[6]。在肿瘤发展过程中，缺氧和营养缺失条件下能够诱发细胞自噬的发生，通过对细胞内物质的降解而是新陈代谢发生变化，促使肿瘤细胞在应激状态下作出适应性反应。Beclin-1是哺乳动物中与酵母菌Atg6同源的基因，在调节自噬起始囊泡形成过程中起重要作用[7]。研究人员发现在小鼠敲除自噬相关基因Beclin-1后，其癌症的发病率明显高于正常小鼠，提示自噬在肿瘤的早起有一定的抑制作用[8]。而在胃癌、乳腺癌研究过程中发现，当细胞自噬受到抑制后，细胞凋亡明显增多[9-11]。而在肿瘤的治疗过程中，通过提高自噬活性可以及时清除化疗或放疗后肿瘤细胞产生的破损细胞器和损坏的蛋白质等有害成分，并为受损的细胞提供应急底物和能量，以促进细胞的修复[12]。由此可见，自噬对肿瘤既有杀伤作用，又有保护作用，合理利用自噬的这一特性，或许能为肿瘤的治疗提供新的思路。

图2 过表达LATS2的SCC-25细胞自噬流(*P<0.05，**P<0.01)Fig 2 Autophagy flux in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(*P<0.05，**P<0.01)

图3 过表达LATS2后SCC-25细胞自噬颗粒(TEM)(* P<0.05)Fig 3 Autophagy granules in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(TEM)(* P<0.05)

LATS2基因位于13q11-q12，负责编码丝/苏氨基酸蛋白激酶，定位于中心体，通过积累微管蛋白和纺锤体的形成来调控细胞周期而发挥抑癌基因的作用[13]。前期的实验发现，在OSCC中LATS2基因的表达与SCC-25细胞的凋亡数量成正相关。Yang等[14]发现在肝癌细胞中上调LATS2基因后，细胞的凋亡明显增加，认为自噬可能在其中扮演了重要的角色。LC3蛋白是酵母自噬相关蛋白(Atg8)的同源蛋白，在合成后其C末端即被Atg4蛋白酶切割转变为LC3-I并散在分布于细胞质内，当自噬被诱导后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺偶联形成LC3-II并始终稳定地锚定于自噬体膜上直至与溶酶体融合，因此通常把LC3-I与LC3-II作为自噬标志物[15]。另外，作为自噬诱导物，Beclin-1也可作为自噬和凋亡的重要桥梁。Bcl-2蛋白家族成员不仅调节着凋亡，而且调节着自噬。研究发现Beclin-1可以通过 BH3区与Bcl-2蛋白家族结合，两者结合后竞争性抑制磷脂酰肌醇3-激酶与Beclin-l的结合，使自噬小体形成过程受阻，使自噬作用受到抑制[16]。当Beclin-1从 Beclin-1与Bcl-2所形成的异源二聚体解离后，Beclin-1激活自噬信号通路使自噬过程启动[17]。金龙等[18]在舌鳞癌细胞SCC-15细胞中发现，在过表达NOD2基因后，诱导细胞自噬可以抑制细胞的增殖和迁移。而实验发现在口腔鳞癌细胞过表达LATS2基因后自噬相关基因LC3 蛋白、Beclin-1蛋白的表达均明显增强；双荧光自噬流以及透射电子显微镜观察到SCC-25细胞质内的自噬体和自噬溶酶体明显增多。先前研究中发现过表达LATS2基因后Bcl-2表达的下调，推测LATS2的上调使Bcl-2的表达受到抑制，这样促使Beclin-1与Bcl-2所形成的异源二聚体解离，释放出更多的Beclin-1，从而激活自噬。

自噬现象贯穿于真核细胞生长的全过程，在OSCC的不同阶段可能发挥着不同的作用。调控OSCC细胞自噬活性，是否能诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞进展，仍需进一步研究。促进自噬被认为是治疗肿瘤的一个潜在途径，而进一步研究LATS2诱导SCC-25细胞发生自噬的机制，有助于为OSCC的研究提供新的思路。