赵云龙，李少军，陈平，刘阳

(1解放军总医院第四医学中心胸外科，北京 100048; 2解放军总医院第一医学中心胸外科，北京 100853)

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的肿瘤之一[1]。大多数肺癌患者早期并无明显症状，很多患者确诊时已处于中晚期且伴有病灶远处转移，因而失去外科手术切除或放疗的机会[2]。美国2019年癌症生存统计报告数据表明，约3/4的肺癌幸存者年龄≥65岁，肺癌确诊的中位年龄为70岁，老年人已成为肺癌的高发人群[3]。近年来，肺癌的新型治疗药物不断问世，其中，分子靶向治疗药物由于其特异性强和毒副反应小等优点，为老年肺癌患者提供了更多治疗选择。但是，该类药物因其适应证存在局限性，并不适合大多数老年肺癌患者。以铂类药物为主的联合化疗方案仍然是老年肺癌治疗的标准一线化疗方案。但是，随着铂类化疗药物在临床中的广泛应用，肿瘤细胞对此类药物的耐药性也逐渐增强，从而导致化疗疗效明显降低，这给老年肺癌的治疗带来了严峻挑战；另一方面，由于老年患者的重要器官功能均存在一定程度的衰退，因药物耐受性欠佳等原因，很多老年患者不得不选择放弃化疗[4]。

microRNA(miRNA)是一类内源性非蛋白编码的小分子RNA，约18～24个核苷酸，可通过与靶mRNA的互补序列相结合在转录后水平调控基因表达，进而诱导靶mRNA的降解或基因沉默[5]。大量研究表明，miRNA对几乎所有已知的癌变过程，包括细胞生长、增殖、分化、血管生成、细胞凋亡以及侵袭和转移均具有调节作用[6]。miR-200c作为miRNA家族的成员，已成为近年的研究热点，其在恶性肿瘤发病机制中的作用备受关注[7]。研究发现，miR-200c家族作为重要的抑癌基因在肺癌组织中呈低表达。近年有研究报道，miR-200c在正常干细胞与乳腺癌干细胞中的表达显著下调，证实miR-200c过表达可通过靶向干细胞再生因子BMI-1显著抑制乳腺癌干细胞的干性特征[8,9]。然而，miR-200c在肺癌耐药性中的作用机制尚不完全清楚。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人肺癌细胞系A549和A549/顺铂(cisplatin, DDP)均购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；顺铂和染色试剂噻唑兰(MTT)购自Sigma生物公司；脂质体2000 购自Invitrogen 生物公司；兔抗人β-actin、TUBB3、survivin和Bcl-2单克隆抗体、山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；siRNA由上海吉玛生物科技有限公司合成。

1.2 细胞准备

采用含10%胎牛血清的F12K培养基培养人肺癌A549细胞及其顺铂耐药株A549/DDP，在实验过程中取对数生长期细胞。以miR-200c模拟物(miR-200c mimics)分别转染A549细胞和A549/DDP细胞并设阴性对照(negative control, NC)组。

1.3 MTS法检测miR-200c对细胞耐药性的影响

取对数生长期细胞，以2×104/ml密度接种于96孔板，每孔100 μl，放置过夜使细胞贴壁生长。将不同浓度的顺铂加入到对应的实验孔中，继续培养72 h后吸去培养基，加入100 μl 0.5 mg/ml 的MTS试剂，继续培养4 h。孵育结束后，在490 nm波长处测定光密度(A490 nm)，并根据公式[细胞抑制率=(1-实验组A490 nm/对照组A490 nm)×100%]计算药物对细胞生长的抑制率。以顺铂浓度对数值为横坐标、细胞抑制率为纵坐标作图并拟合抑制曲线，求得IC50值。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

首先根据实验设计分组以miR-200c mimics转染，转染48 h后收集细胞，以PBS缓冲液洗涤2次；取细胞数为2×105个的细胞悬液，离心并弃去上清液，加入195 μl结合液，再次轻轻反复吹打细胞悬液后，加入5 μl AnnexinV-FITC混匀，在室温和避光环境下继续孵育10 min后，离心，弃上清液。再加入10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，混匀，在1 h内用流式细胞术检测。以上步骤重复操作3次。

1.5 检测A549/DDP细胞中多种蛋白的表达

取miR-200c mimics转染的、处于对数生长期的A549/DDP细胞裂解液提取蛋白。采用二辛可宁酸法测定细胞裂解液中的蛋白含量。12%SDS-PAGE电泳分离后，采用半干转移法将分离胶内的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。用5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1% Tween 20，pH7.5)封闭PVDF膜后洗膜，滴加一抗；4℃下过夜培养，洗涤去除一抗后，加HRP标记的二抗在室温下孵育2 h，洗膜；凝胶成像分析系统曝光成像并分析图像，以β-actin为内参照计算蛋白的相对含量。

1.6 采用实时PCR法检测miR-200c和TUBB3mRNA的表达

收集转染后的各组细胞，使用TRIzol试剂提取总RNA，根据试剂盒说明书要求操作，反转录合成cDNA并进行PCR反应，反应条件为95℃ 20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃ 10 s，共40个循环。miR-200c表达量以2-ΔΔCT表示。miR-200c反转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG-GATACGACTCCATC-3′；PCR上游引物：5′-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。TUBB3上游引物:5′-AAAGAATTCGACGCCACGGCCGAGGAAGAGG-3′，下游引物:5′-AAAAAGCTTAAGGGTATCTGACAGCAATAGA-3′。

1.7 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析实验数据。结果以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。P<0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞株的miR-200c表达情况

A549转染组中的miR-200c的表达水平显著高于A549/DDP转染组(P<0.001；图1A)；A549/DDP miR200c mimics 转染组中的miR-200c表达水平明显高于NC组(P<0.01；图1B)。

2.2 miR-200c表达对A549/DDP细胞顺铂敏感性的影响

与NC组相比，miR200c mimics组中的A549/DDP细胞株对顺铂的敏感性显著增加，IC50值由(37.3±3.1)μmol/L下降至(15.3±3.3)μmol/L(P<0.01)。

2.3 miR-200c对A549/DDP细胞凋亡的影响

采用Annexinv-FITC/PI 双染法检测miR-200c过表达对A549/DDP细胞凋亡的影响。结果发现：过表达miR-200c的A549/DDP组的细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.01；图2)。

2.4 miR-200c对A549/DDP细胞中survivin和Bcl-2蛋白表达的影响

为了进一步探讨miR-200c逆转A549/DDP耐药性，我们观察了miR-200c是否与肿瘤耐药相关基因survivin和Bcl-2的蛋白表达相关。结果发现A549/DDP过表达miR-200c后，survivin和Bcl-2蛋白表达明显下调(图3)。

2.5 miR-200c增加肺癌细胞对顺铂的耐药性的机制

通过生物信息学分析发现，TUBB3可能是miR-200c的靶基因，而survivin和Bcl-2并非miR-200c的靶蛋白(图4A)。为了验证这一假设，我们首先在A549/DDP细胞中转染miR-200c mimics，检测TUBB3蛋白和mRNA的表达情况。结果发现，过表达miR-200c后，TUBB3蛋白和mRNA的表达均下调(P<0.01；图4B,C)；其次，我们构建了TUBB3 3′UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体，并利用双荧光素酶活性分析检测miR-200c对TUBB3基因表达的调控作用和结合位点(P<0.01；图4D)。这些结果均证实TUBB3为miR-200c的下游靶基因。最后，为了与miR-200c mimics转染组比较，我们在过表达miR-200c的A549/DDP细胞株中同时转染了pcDNA-TUBB3质粒，结果发现survivin和Bcl-2蛋白的表达较miR-200c mimics组上调(图4E)。上述结果证实miR-200c可通过下调其下游靶分子TUBB3的基因表达下调survivin和Bcl2蛋白的表达，最终增加肺癌细胞对顺铂的耐药性。

图1 A549/DDP细胞中miR-200c的表达

图2 各组细胞凋亡率结果

图3 各组survivin和Bcl-2蛋白的表达情况

Figure 3 Expression of survivin and Bcl-2 proteins in each group

图4 miR-200c通过调控其下游靶分子TUBB3而影响survivin和Bcl2的表达

3 讨 论

肺癌的发病率和死亡率居高不下，是最常见的恶性肿瘤之一。多数肺癌患者，尤其是老年患者，确诊时已属于中晚期。随着全球老龄化的加剧，老年肺癌患者的人数不断增加。由于老年肺癌患者身体的各个器官机能均处于衰退阶段，而且患有的基础疾病较多，故外科治疗风险较大；另外，化疗虽然是中晚期肺癌治疗相对安全有效的方法，但由于老年患者肾功能减退以及药物治疗不耐受等原因，严重影响了其在老年肺癌患者中的疗效[10，11]。

近年来，由于治疗方案的不断优化，靶向药物不断涌现，老年肺癌的治疗现状得到了明显改善[12]。靶向药物治疗和免疫疗法在肺癌治疗中已取得重大进展，而且效果较为显著，但其高昂的治疗费用却使得很多患者望而却步。目前铂类化疗方案仍然是最常用的标准治疗方案，而且顺铂也是最经济的治疗药物。顺铂可通过诱导细胞凋亡阻止肿瘤细胞的生长，其作用机制为通过靶向DNA和拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)抑制DNA的转录与合成[13]。但在肺癌治疗的临床实践中，顺铂较高的耐药率，使其疗效明显降低[14]，这一问题亟待解决。

因此，解决肿瘤细胞的耐药性、研究逆转肿瘤耐药性的机制与方法对于提高老年肺癌患者的生存率和改善生活质量具有非常重要的意义。

近年来的大量研究发现，铂类药物在抗肿瘤作用和肿瘤耐药性中的机制甚为复杂。这些机制通常与胞饮过程、铜离子受体、谷胱甘肽、铜转运P型ATP酶(ATP7B)以及DNA修复蛋白等多种因素有关[4]。因此，目前尚未发现合适的靶点能够逆转肿瘤细胞对铂类药物的耐药性。近来，miRNA作为调控肿瘤细胞侵袭、转移、耐药及凋亡的关键因子而备受关注[15,16]。其中miR-200c参与对多个经典细胞信号通路的调节，从而调控肿瘤细胞的侵袭、耐药及凋亡等过程。在临床实践中，尤其是老年肺癌患者，通常由于没有较好的外科治疗条件而不得不将化疗作为首选治疗方法，但肿瘤细胞对化疗不敏感，这是所有临床医师面临的最大挑战，因为这不仅会增加患者的痛苦，而且可能会延误治疗时机，降低疗效。miR-200c在肿瘤中的异常表达是抗肿瘤治疗疗效评估的一个重要因素，其作为一种生物标志物，使得个体化诊断及治疗成为可能，以此增加抗肿瘤疗效，同时也能缓解恶性肿瘤患者的心理应激状态[17-19]。survivin仅在肿瘤细胞和胚胎组织中表达，其可抑制肿瘤细胞的凋亡并具有肿瘤特异性，是细胞凋亡抑制蛋白家族的成员，能够促进细胞增殖和血管形成[20]，已成为一个公认的具有较高价值的肿瘤治疗靶点。Bcl-2蛋白可抑制肿瘤细胞的凋亡。研究发现，肿瘤细胞的耐药性与Bcl-2在肿瘤中的高表达密切相关[21, 22]。有研究发现，在非小细胞肺癌顺铂耐药的细胞株A549/DDP中，下调survivin与Bcl-2蛋白的表达可逆转肿瘤细胞的耐药性。

本研究结果表明，在非小细胞肺癌顺铂耐药的A549/DDP细胞株中，miR-200c表达明显下调，表明miR-200c的低表达与肿瘤产生耐药性的过程密切相关。miR-200c mimics转染显著降低了survivin和Bcl-2蛋白的表达，同时可显著增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。这些结果表明，过表达miR-200c可能通过对survivin和Bcl-蛋白表达水平的调节显著减少细胞株的顺铂耐药性。另外，本研究同时探讨了miR-200c对survivin和Bcl-2蛋白表达的调控过程。TUBB3是唯一一种能够影响微管稳定性的微管蛋白，其表达的差异直接与化疗药物敏感性相关。有研究发现，在乳腺癌肿瘤细胞中，上调miR-200c表达可通过抑制TUBB3表达增加肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。本研究同样发现肺癌细胞过表达miR-200c后，TUBB3蛋白和mRNA的表达水平均下调。而且，在过表达miR-200c的A549/DDP细胞中过表达TUBB3基因后，结果发现survivin和Bcl-2蛋白的表达高于miR-200c mimics组。综上，我们发现miR-200c过表达可明显增加顺铂在肺癌治疗中的敏感性，能够导致与肿瘤耐药相关基因survivin和Bcl-2的蛋白表达水平下调，进一步证实 miR-200c可通过下调其下游靶分子TUBB3基因的表达从而下调survivin和Bcl-2蛋白表达，以增加肺癌细胞对顺铂的耐药性。

综上所述，miR-200c通过对TUBB3基因表达调节在逆转肺癌顺铂耐药性的过程中发挥重要作用，其作用机制可能与多种耐药和细胞凋亡相关蛋白的表达调控密切相关。对相关耐药机制的进一步明确可为老年肺癌患者制定个体化治疗策略提供参考依据。