何勇勇，方长英，朱传卫*，张青松

1.宣城职业技术学院内科教研室(安徽 宣城 242000) 2.宣城市中心医院检验科(安徽 宣城 242000)

原发性肝癌是世界上最具侵袭力的癌症之一，位居恶性肿瘤死亡率第3位[1]。近年来临床治疗肝癌取得显著进步，但5年生存率仍然较低，主要原因为肝癌发病隐匿、诊断延迟和术后易复发等[2-4]。因此需要寻找可靠标志物以提高肝癌早期诊断率。基因组学研究证实[5]人类大多数基因转录物为非编码RNA，其中最多的是长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)。研究发现[6-8]LncRNAs不仅具有保持mRNA稳定性、选择性基因剪接、转录后基因调控和DNA表观遗传修饰等功能，同时在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用[9]，并在肿瘤患者血清中稳定出现并被检测[10]。Svoboda等[11]研究发现LncRNA HOTAIR在肠癌患者血液中表达量相对于健康人群出现较为显著升高，且高表达LncRNA HOTAIR患者复发率较高且预后较差，这些研究表明血液中LncRNAs可能成为肿瘤标志物用于诊断和预后判断。LncRNA H19是位于人类11号染色体的母系表达印迹基因，在哺乳动物发育中起重要作用，随着研究深入其病理学功能开始被发现[12-14]。LncRNA H19在多种肿瘤组织中出现上调并与患者复发和预后有密切关系，如：肠癌、食道癌、子宫内膜癌和非小细胞肺癌等[15-18]，而LncRNA H19作为血清肿瘤标志物用于肝癌诊断和预后判断研究较少，本研究通过观察LncRNA H19在肝癌患者和健康人血液中表达差异，分析其与病理因素之间的关系，运用细胞实验了解其生物学特性，为临床肝癌诊疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2018年1月-2019年10月在宣城市中心医院病理科确诊为原发性肝癌的61例肿瘤患者为研究对象，其中男性52例，女性9例；年龄26～69岁，平均(49.6±9.5)岁。纳入标准：①同意参加本实验；②术前未经过放疗、化疗和分子靶向治疗等；③有完整的病历资料；④术后病理确诊为原发性肝癌。排除情况：①伴有其他恶性肿瘤；②有慢性病、风湿和心脑血管意外等疾病。另选择参加体检的健康成年人61例为对照组，其中男性52例，女性9例；年龄25～69岁，平均(49.2±9.1)岁，纳入标准：①同意参加本实验；②实验阶段身体健康无疾病；③资料完整，排除情况：体检证实有疾病存在。两组患者年龄、性别和饮酒情况等资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得宣城市中心医院伦理委员会批准(No.XCSZXYY 201711)，所有参与研究的患者和健康志愿者均签署知情同意书。

1.2血清LncRNAH19的检测采集两组研究对象静脉血10 mL，肝癌患者血液术前采集；健康志愿者血液在体检时采集。血液样本2 000 r/min离心后吸取上清液至EP管中，立即交由金域医学检验公司完成对血清中LncRNA H19检测。按TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)说明书提取血液和细胞中的RNA，采用蛋白核酸定量仪测定RNA浓度和纯度，样品合格后将其反转录为cDNA，随后按RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)说明书对LncRNA H19进行扩增，反应体系为20 μL，扩增条件：95℃变性45 s，随后95℃ 20 s、60℃ 10 s、72℃ 15 s，循环40次。用2-△△Ct方法计算LncRNA H19基因的相对表达量。LncRNA H19引物和内参β-actin由上海吉玛科技公司设计合成，LncRNA H19引物序列:Forward:5′-GATCTAATCGAAGCTGACGTACGAG-3′,Reverse:5′-CTACTTGACTTGCTAGCTACCTGAC-3′；内参β-actin:Forward:5′-CTCGCTTTGGCAGCAGATCA-3′,Reverse:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3细胞培养和转染肝癌细胞株HepG2细胞购自第二军医大学临床实验中心，使用10%胎牛血清的DMEM培养液(GIBCO公司)。选择生长良好无污染的HepG2细胞作为转染对象，使用流式细胞仪测量其浓度，并接种于6孔板中。按照Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)说明书配置转染试剂，实验设置转染组(siRNA组)和阴性对照组(NC组)，各做5个复孔。24 h后收集细胞利用RT-PCR检测LncRNA H19抑制效率，siRNA:Sense:5′-GAUUGTCATGACCUUGCCCTT-3′，Antisense:5′-UTGGUAGUACTUGCAGCUCTT-3。

1.4CCK-8检测HepG2细胞增殖能力取转染后的HepG2细胞，胰酶消化后流式细胞仪计数，以1×104/孔接种于96孔板中，实验分为siRNA和NC组。细胞连续培养4 d，按CCK-8(Invitrogen公司)说明书使用酶标仪测定每组各孔的光密度(OD)值，实验重复3次取各组均值，并依据实验结果绘制两组HepG2细胞生长曲线。

1.5Transwell检测HepG2细胞侵袭力侵袭实验前在Transwell小室中加入Matrigel胶，凝固后待用。收集siRNA组和NC组HepG2细胞，胰酶消化后使用流式细胞仪将其浓度调整为1×105/mL，随后将100 μL细胞悬液加入Transwell小室中，小室放入24孔板内，小室外加入700 μL DMEM完全培养基，每组设3个复孔。培养24 h后取出小室，洗涤后擦去Matrigel胶，台盼蓝染色后显微镜计数穿过膜的HepG2细胞数。

2 结果

2.1LncRNAH19在原发性肝癌血液中表达及诊断价值Real-time PCR检测结果显示与健康对照组相比肝癌患者血液中LncRNA H19表达量显著升高(1.592±0.460 vs 2.355±0.609,t=7.806,P<0.001)，见图1。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示LncRNA H19诊断肝癌的曲线下面积为0.836(95%CI:0.764-0.907,P<0.001)，当cut-off值为2.015，其敏感性和特异性为80.3%和88.3%，见图2。

2.2LncRNAH19表达下调后HepG2细胞增殖和侵袭能力变化转染实验表明siRNA能够有效抑制HepG2细胞中LncRNA H19表达(P<0.001)，见图3；CCK-8检测结果显示HepG2细胞中LncRNA H19表达下调后细胞增殖能力出现显著下降(P<0.01)见图4；Transwell实验显示LncRNA H19表达下调后HepG2细胞穿过Transwell小室膜的细胞数目明显下降(P<0.001)，见图5。上述实验说明LncRNA H19下调后肝癌细胞增殖和侵袭能力减弱。

图1 两组血清中LncRNA H19表达水平

图2 受试者工作特征曲线(ROC)

图3 两组HepG2细胞中LncRNA H19被siRNA干扰后表达

图4 siRNA干扰实验组HepG2细胞中LncRNA H19表达

图5 两组HepG2细胞中LncRNA H19表达

2.3血清中LncRNAH19表达与肝癌临床病理特征之间的关系统计分析发现肝癌血液中LncRNA H19表达水平与性别、年龄、AFP、饮酒、HbsAg、肝硬化和肿瘤数目无相关性；肿瘤直径>5 cm、有血管侵犯、肝癌细胞Edmondson分级和TNM分期较差的患者血液中LncRNA H19表达升高(P均<0.05)，见表1。

表1 LncRNA H19表达与肝癌病理参数的相关性(n=61)

3 讨论

近年来肝癌研究取得了较大进展，但原发性肝癌具体发病机制仍然未知，因此早诊断并及时进行肿瘤切除是目前最佳治疗方法[4]。研究表明LncRNAs可以作为血清肿瘤标志物用于癌症临床诊断[7]，Li等[19]报道非小细胞肺癌患者血清中LncRNA HOTAIR表达水平高于健康对照组，其表达量与肺癌肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移相关，LncRNA HOTAIR诊断非小细胞肺癌的准确性为79.1%。而LncRNA H19在肝癌血液中的表达差异及临床意义研究较少。

本研究发现肝癌血清中LncRNA H19表达水平显著高于健康志愿者，进一步分析显示肿瘤直径>5 cm、有血管侵犯、肝癌细胞Edmondson分级和TNM分期较差的患者血液中LncRNA H19表达显著升高(P均<0.05)，随后的ROC分析表明LncRNA H19诊断肝癌准确性为83.6%，敏感性和特异性分别为80.3%和88.3%，研究结果初步表明LncRNA H19可能参与肝癌的生长和侵袭，为进一步了解LncRNA H19在肝癌细胞中的生物学特性，本研究采用siRNA下调HepG2细胞中LncRNA H19表达，应用CCK-8和Transwell小室检测肝癌细胞的增殖和侵袭能力变化，结果显示LncRNA H19下调后肝癌细胞的增殖和侵袭能力受到了抑制(P<0.01)。上述研究证实LncRNA H19参与肝癌的生长和侵袭，其表达水平在肝癌患者血液中显著升高，有可能作为原发性肝癌的诊断标志物。

在实验中可以观察到LncRNA H19在血液中稳定表达，且血液样本采集方便，使得LncRNA H19作为血清肿瘤标志物成为可能，但其实际运用于临床肝癌诊断仍有较多问题，如扩大样本量进一步验证LncRNA H19是否为肝癌诊断的可靠指标，其他良性肝脏疾病患者血液中LncRNA H19是否出现显著升高，以及是否能与其他肝癌标志物联合检测用于提高肝癌诊断的准确性和敏感性，这些将是下一步的研究方向。总之血液中LncRNAs作为肿瘤标志物的研究目前仍处于初级阶段，但随着研究深入，血清LncRNA H19有可能作为肝癌诊断的一个重要分子标志物。