程忠强 蒋成义 韩跃峰 王斌

有关研究资料显示［1］,miR-34a在鼻咽癌组织中表达下调,并与患者不良临床病理特征相关；生物信息学分析显示,受体络氨酸激酶家族成员AXL的mRNA3’-UTR具有miR-34a特异性结合的序列,是miR-34a的下游靶点之一。研究证实［2］,AXL mRNA和蛋白的表达水平在鼻咽癌组织中均显著高于对应癌旁组织。鼻咽癌组织中AXL高表达与出现远处转移和较高的TNM分期及患者不良预后显著相关。因此,推测miR-34a可能在鼻咽癌细胞中通过抑制AXL/PI3K/Akt/Snail信号通路进而抑制癌细胞上皮间质转化,最终发挥抗肿瘤侵袭作用。本研究进一步分析miR-34a在鼻咽癌组织中的表达情况及其对患者预后的影响,利用基因转染技术,在鼻咽癌细胞株中过表达miR-34a,研究其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响,阐明miR-34a在鼻咽癌侵袭、转移中的作用机制,探讨其应用于鼻咽癌基因治疗的潜在价值,为鼻咽癌治疗提供新思路。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院耳鼻喉头颈外科2018年1月～2019年1月收治的60例鼻咽癌患者,根据miR-34a在鼻咽癌组织中的表达状态分为miR-34a高表达组(鼻咽癌组织中miR-34a相对表达量/对应癌旁组织中miR-34a相对表达量≥1)、miR-34a低表达组(miR-34a相对表达量/对应癌旁组织中miR-34a相对表达量＜1),各30例。miR-34a低表达组男18例,女12例；平均年龄(67.3±4.9)岁。miR-34a高表达组男20例,女10例；平均年龄(66.8±5.0)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。纳入标准：患者均在知情下参与；均经过医院伦理委员会批准通过；未接受过放化疗。排除标准：中途退出本次研究者；依从性差者。

1.2方法 患者均行手术切除或病理活检的鼻咽癌及对应癌旁组织。

1.2.1培养方法 在37°C细胞培养箱中,每隔48～72 h使用酶消化细胞进行细胞传代,后续实验应用传代2～3代细胞。

1.2.2定时定量聚合酶链式反应检测miR-34a在不同细胞株中的表达情况 收集细胞后加入Trizol (1 ml)、异丙醇,离心后,收集RNA沉淀物；检测RNA的纯度以及完整性,检测miR-34a；按照试剂说明书配置反转录反应体系,合成cDNA。

1.2.3细胞划痕试验 取转染48 h后的CNE-2细胞,以含10% FBS的DMEM培养基重悬并接种于6孔板上,接种密度以过夜可铺满平板为准。每孔细胞均采用200 μl无菌移液器吸头纵向划线。以PBS洗去悬浮细胞,采用无血清DMEM培养基在含5% CO2的37℃恒温箱中继续培养48 h,倒置显微镜下观察并拍摄细胞迁移情况。

1.2.4细胞侵袭试验 基质胶使用无血清DMEM培养基稀释至1 mg/ml后包被transwell小室底部膜的上室面。取转染48 h后的CNE-2细胞,以无血清DMEM培养基重悬细胞并调整细胞密度至2.5×105/ml。在transwell小室内加入200 μl细胞悬液,将transwell小室置于24孔板中,并在24孔板内添加750 μl含10%FBS的DMEM培养基。细胞在含5% CO2的37℃恒温箱中继续培养24 h后置于4% 多聚甲醛溶液中固定2 min,然后于甲醇中浸润20 min。棉棒轻柔擦去transwell小室底部膜的上室面细胞,将下室面置于0.3%结晶紫溶液中染色15 min,PBS洗去多余染料。在显微镜下观察、计数侵袭细胞数目。

1.3观察指标 比较鼻咽癌组织及对应癌旁组织中miR-34a的相对表达量；不同临床病理特征患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量；miR-34a高表达组和miR-34a低表达组患者5年总生存率和5年无病生存率。

1.4统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。采用Kaplan-Meier生存曲线法分析生存率。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1鼻咽癌组织及对应癌旁组织中miR-34a的相对表达量比较 鼻咽癌组织miR-34a的相对表达量(2.654±0.198)低于对应癌旁组织的(5.401±0.447),差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 鼻咽癌组织及对应癌旁组织中miR-34a的相对表达量比较(±s)

表1 鼻咽癌组织及对应癌旁组织中miR-34a的相对表达量比较(±s)

注：与对应癌旁组织比较,aP＜0.05

2.2不同临床病理特征患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量比较 不同年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)；不同淋巴结转移和TNM分级患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量比较(±s)

表2 不同临床病理特征患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量比较(±s)

注：不同淋巴结转移和TNM分级比较,P＜0.05

2.3miR-34a高表达组和miR-34a低表达组患者5年总生存率和5年无病生存率比较 miR-34a高表达组患者5年总生存期率和5年无病生存率分别为60.0%(18/30)、33.3%(10/30),与miR-34a低表达组的60.0%(18/30)、36.7%(11/30)比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

miRNA是一种内源性非蛋白编码单链小分子RNA,通过与靶基因3’未翻译区域结合介导基因转录后水平的调控功能［3］。miRNA在细胞生长和细胞分化以及肿瘤形成等生理病理过程中起着重大作用,现阶段来看,在多种肿瘤中已经检测到miRNA的表达,并且与肿瘤的生长和肿瘤的转移等恶性生物学特征密切相关［4］。因此,研究miRNA对肿瘤细胞的具体作用机制且改变细胞内的表达水平等具有重要意义。

miRNA参与到鼻咽癌患者的恶性转化过程,通过不同靶点发挥出抑癌基因作用。有关研究资料显示［5］,miR-34a低表达或者失表达是肿瘤演化中的常见情况,miR-34a主要扮演抑癌基因。有关研究显示［6］,miR-34a在鼻咽癌组织中表达下调,并与患者不良临床病理特征相关,但在鼻咽癌发生发展中的作用尚不清楚。本文研究结果显示,鼻咽癌组织miR-34a的相对表达量(2.654±0.198)低于对应癌旁组织的(5.401±0.447),差异有统计学意义(P＜0.05)。提示鼻咽癌组织miR-34a相对表达量低于正常水平。miR-34a诱导细胞周期停滞,促进细胞凋亡,增强放化疗的敏感度。除此之外,miR-34a还参与到肿瘤干细胞分化过程之中,促使肿瘤干细胞分化,有关研究显示［7］,miR-34a可显著阻止肿瘤的生长。由于不同肿瘤具有不同的遗传学背景,因此miR-34a的抑制肿瘤增殖机制也表现不同。体外实验研究资料显示［8］,miR-34a过度表达可显著抑制鼻咽癌患者的克隆形成能力以及增殖能力,与此同时促进肿瘤凋亡。

本文研究结果显示,不同年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)；不同淋巴结转移和TNM分级患者鼻咽癌组织的miR-34a相对表达量比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。miR-34a高表达组患者5年总生存期率和5年无病生存率分别为60.0%(18/30)、33.3%(10/30),与miR-34a低表达组的60.0%(18/30)、36.7%(11/30)比较差异无统计学意义(P＞0.05)。提示miR-34a的相对表达与不良临床病理特征密切相关。有关资料显示,miR-34a与EB病毒感染关系较为密切,EB病毒感染状态与miR-34a密切相关。由于鼻咽癌与EB病毒感染密切相关,因此在有关研究中需谨慎选择实验对象［9,10］。

综上所述,miR-34a在鼻咽癌细胞中的表达量低于正常细胞,并且与患者的不良临床病理特征密切相关,上调miR-34a表达能够显著抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭。