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类叶牡丹提取物通过NF-κB信号通路影响类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖及凋亡

2020-06-18曾茂湘吕兆宇李妍

沈阳医学院学报 2020年3期
关键词:滑膜通路关节

曾茂湘,吕兆宇,李妍

(深圳市龙岗区第二人民医院外二科,广东 深圳 518112)

类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis,RA) 是一种由环境因素和遗传因素共同影响,与多种基因有关的自身免疫炎性疾病,严重者可出现关节畸形,致残率非常高,严重影响患者的日常工作和生活[1]。在RA的病理过程中机体的免疫调节网络失衡,促炎因子分泌增多,炎性细胞募集活化,诱发成纤维样滑膜细胞 (fibroblast-like synoviocytes,FLS)异常增殖,表现出类肿瘤细胞样的特性,分泌基质金属蛋白酶 (MMPs)和炎性因子,参与炎症反应,损伤骨及关节软骨[2]。NF-κB信号通路介导的细胞凋亡对FLS的存活和增殖有重要的影响[3]。 类叶牡丹 (Caulophyllum robustum Maxim,CRM)临床上常被用于跌打损伤、RA、胃痛等治疗,有活血理气的功效。本文以从RA患者关节处分离的FLS为细胞模型,研究CRM提取物 (CRME)抗RA的药理作用及NF-κB信号通路的参与机制,为CRM的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 选取2018年12月至2019年12月在我院骨科或者风湿病科因RA行关节清理手术的25例患者的滑膜组织,分离出FLS为RA-FLS组,其中男7例,女18例,平均年龄 (55.86±12.93)岁;另取同期因非RA行手术患者的滑膜组织,分离出FLS为空白对照,其中男10例,女15例,平均年龄 (53.71±13.07) 岁。 纳入标准: (1)RA患者符合2010年美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟的RA分类标准; (2)对照组患者为因外伤进行关节手术的非RA患者; (3)患者对研究知情同意且签署协议书。排除标准: (1)患者存在严重心脑血管或肝肾疾病; (2)肿瘤、痛风、甲亢、糖尿病、结核病及其他内分泌代谢疾病患者;(3)术前进行免疫治疗的患者;(4)存在除RA外的自身免疫性疾病患者。本研究经医院伦理委员会审查,研究对象的一般资料比较差异无统计学意义。

1.2 药品和试剂 CRM根茎 (四川恒源医药有限公司)由黑龙江中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品;PDTC(NF-κB信号通路抑制剂) (美国AbMole公司);四甲基偶氮唑蓝 (MTT) (上海碧云天生物技术有限公司);白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-4(IL-4)、血管内皮生长因子(VEGF)、Bax、Bcl-2、p65的ELISA试剂盒 (美国R&D Systems公司);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司);DMEM培养基 (美国Gibco公司);胎牛血清 (美国Hyclone公司);青霉素、链霉素 (上海碧云天生物技术有限公司);DMSO(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 仪器 SW-CJ-2F超净工作台 (上海博迅医疗生物仪器股份有限公司);HEARcell 150i二氧化碳培养箱 (美国赛默飞世尔科技公司);FV1000共聚焦显微镜 (日本奥林巴斯);SpectraMax Paradigm酶标仪 (上海美谷分子仪器有限公司);BD FACSCalibur流式细胞仪、Avanti J-E离心机 (美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 CRME的提取 取1 kg CRM根茎,加入95%乙醇浸泡24 h,回流提取2 h,重复2次,以70%乙醇和纯净水 (V/V)于AB-8大孔树脂洗脱,将洗脱液浓缩,浓缩液静置24 h后抽滤,将滤液于55℃进行旋蒸,收集固体粉末,称重,得212.53 g,提取率为21.253%。

1.4.2 FLS分离、培养及鉴定 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤无菌条件下收集的关节滑膜组织3次,去除脂肪组织后将其剪碎,以胰酶和胶原酶依次消化30 min和3 h,用DMEM培养基重悬FLS,置于5%CO237℃条件下培养,传至2~3代进行后续实验。原代细胞培养3代后,细胞形态呈三角形或梭形,免疫荧光染色显示波形蛋白 (Vimentin) (+)、 CD68 (-)。

1.4.3 MTT法检测FLS细胞增殖活性 取正常组、RA-FLS组原代FLS于96孔细胞培养板中接种1×105个细胞/孔,培养24 h后将上清弃去。将RA-FLS组分为5组,RA-FLS组加入不完全培养基,给药组加入含浓度为 50、100、500μg/ml CRME的不完全培养基和给予含50μmol/L PDTC的不完全培养基;正常FLS为对照,加入不完全培养基。每个组别设置5个复孔。继续培养24 h,每孔加入5 mg/ml的 MTT溶液20μl,37℃ 5%CO2培养箱中孵育4 h,弃去上层培养液,加入二甲基亚砜 (DMSO)溶液150μl,于摇床上振荡10 min,用酶标仪测各孔在490 nm处的吸光度值,计算抑制率。

1.4.4 ELISA法检测细胞因子表达水平 按照ELISA试剂盒说明书检测 IL-6、IL-4、VEGF、Bax、Bcl-2、p65的表达水平。实验重复3次。

1.4.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况 用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞,PBS重悬后离心,以Annexin V-FITC结合液重悬细胞,以Annexin V-FITC和碘化丙啶染色,避光室温孵育20 min后冰浴,流式细胞仪检测后采用CFlow Plus软件分析。实验重复3次。

1.5 统计学方法 采用Graphpad prism 6软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示,各组的OD值、细胞因子表达水平和凋亡率的组间比较采用One-way ANOVA检验和 Student′st检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRME和PDTC对FLS增殖活性的影响 给药后24 h,MTT法检测FLS的增殖活性,RA-FLS组与正常组增殖活性比较差异有统计学意义 (P<0.01); RA-FLS+PDTC 组和 RA-FLS+不同浓度CRME (50、 100、 500 μg/ml) 组 OD 值分别与RA-FLS组比较差异均有统计学意义 (P<0.05)。见表1。

表1 CRME和PDTC对FLS增殖活性的影响

2.2 CRME和PDTC对FLS IL-6、IL-4、VEGF、Bax、Bcl-2、p65表达的影响 和正常组比较,RA-FLS组细胞IL-6、IL-4、VEGF、Bcl-2、p65表达水平显著升高 (P<0.01); 和 RA-FLS组比较, RA-FLS+50、 100、 500 μg/ml CRME 组和 RA-FLS+PDTC组 IL-6表达水平显著降低 (P<0.01), RA-FLS+100、 500 μg/ml CRME 组和 RA-FLS+PDTC组IL-4表达水平显著升高 (P<0.05或0.01), RA-FLS+500 μg/ml CRME 组 VEGF表达水平降低 (P<0.05)。 和RA-FLS组比较,RAFLS+PDTC 和 RA-FLS+ 50、 100、 500 μg/ml CRME组 Bax的表达水平显著升高 (P<0.05或0.01), RA-FLS+50、 100、 500 μg/ml CRME 组和RA-FLS+PDTC组Bcl-2的表达水平差异无统计学意义 (P>0.05), RA-FLS+500 μg/ml CRME 组和RA-FLS+PDTC组p65的表达水平均显著减低 (P<0.01)。 见表 2、 表 3。

表2 CRME和PDTC对IL-6、 IL-4、 VEGF表达的影响 (pg/ml)

表3 CRME和PDTC对Bax、Bcl-2、p65表达的影响

2.3 CRME和PDTC对FLS细胞凋亡的影响 正常组细胞凋亡率为 (2.17±0.98)%,RA-FLS组为 (3.79±0.46)%,2组比较差异无统计学意义(P>0.05); RA-FLS+50、 100、 500 μg/ml CRME组和RA-FLS+PDTC组细胞凋亡率分别为 (5.48±1.13)%、 (8.91±0.67)%、 (11.37±1.26)%和(6.83±1.02)%, 和 RA-FLS组比较, 100、 500 μg/ml的CRME和PDTC能够增加细胞凋亡率 (P<0.05)。

3 讨论

RA是慢性进行性的自身免疫疾病,临床表现为四肢关节的侵袭性、对称性、多关节的关节炎症,病变关节出现肿胀、疼痛及功能障碍,严重者导致关节畸形,严重影响日常生活质量[4]。RA与机体的免疫功能异常有紧密关系,其病理过程有诸多细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞内信号分子和转录因子参与[5]。糖皮质激素和非甾体类抗炎药是当前治疗RA的主要治疗药物,但是特效治疗药物仍然缺乏,且当前抗RA药物的长期使用也存在较多的不良反应。CRM性温,味苦、辛,有理气止痛和祛风活血的功效,研究显示其作用可能和抑制非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫有关[6]。生理情况下,FLS和巨噬细胞样滑膜细胞组成滑膜结构的衬覆细胞层,通过分泌润滑液和细胞外基质,参与维持关节的正常活动功能[7]。当关节出现炎症反应时,某些细胞因子或者趋化因子可激活FLS,激活的FLS异常增殖并加重炎症反应,形成血管翳,同时能够侵蚀骨和软骨,促进骨降解,参与RA的病理进程[8]。因此,抑制RA-FLS的过度增殖或促进其凋亡可能成为治疗RA的有效方式。

本研究选择CRME和NF-κB信号通路的抑制剂 (PDTC),以FLS为研究对象,观察CRME和PDTC对RA-FLS细胞增殖和凋亡的影响及和NF-κB信号通路相关的分子机制。对PDTC和各剂量组的CRME对RA-FLS细胞增殖活性的影响进行探讨,结果显示,和正常组比较,RA-FLS组的细胞增殖活性显著提升;和RA-FLS组比较,PDTC和各剂量组的CRME均减少了RA-FLS的异常增殖。流式细胞术检测PDTC和CRME对RA-FLS凋亡的影响,结果显示RA-FLS组和正常组细胞的凋亡率差异无统计学意义,PDTC和100、500 μg/ml的 CRME升高了 RA-FLS细胞的凋亡率,提示CRME可能通过抑制RA-FLS的异常过度增殖和促进RA-FLS的凋亡发挥抗RA的药理作用。

IL-6和IL-4等细胞因子参与炎症过程,存在于关节滑膜和血清中。IL-6可促进炎症相关的Th17细胞的分化和B细胞的合成,参与炎症过程[9-10]。本研究结果显示,和正常组比较,RAFLS组的IL-6表达水平显著升高,给予PDTC和各剂量组的CRME均能显著降低IL-6的表达水平,提示CRME的抑制炎症反应的作用效果,可能和抑制NF-κB信号通路有关。IL-4为Th2细胞分泌的抑制炎症反应的细胞因子,能够抑制Th1细胞增殖,拮抗TNF-α的炎症效应[11]。和正常组相比,RA-FLS组的IL-4表达水平显著升高,给予PDTC和100、500μg/ml的CRME均能显著升高IL-4的表达水平,提示CRME可能和对Th1/Th2细胞增殖和分化的影响有关。NF-κB信号通路活化后,释放p65并转移入细胞核内,进而调节炎症和凋亡相关的基因表达[12]。 Okamato等[13]研究发现RA病理过程中,NF-κB信号通路活化,抑制其活性能够改善RA。本研究结果显示,和正常组相比,RA-FLS组的p65表达增多,提示NF-κB信号通路活化;PDTC和500μg/ml的 CRME能够降低p65表达,提示CRME通过抑制NF-κB信号通路活化进而发挥改善炎症和对RA的治疗作用。

研究显示,VEGF能够提升血管内皮细胞形成管腔的能力,诱导血管内皮细胞增生和迁移,与血管翳的形成密切相关,RA患者血清中的VEGF水平高于健康对照组[14-15]。软骨破坏也与其表达升高有关,本研究结果显示和正常组相比,RAFLS组细胞表达 VEGF增多;500μg/ml的 CRME能够降低RA-FLS表达VEGF,PDTC则无此效果,RA病理过程中血管新生受到多种因素的影响,有研究显示缺氧能够激活血管生成的级联反应,促进RA的发展[16],提示CRME可能通过降低VEGF表达发挥抗RA作用。Bax是经典的促凋亡因子,Bcl-2发挥抗凋亡作用,Perlman等[17]研究显示Bcl-2在RA患者的滑膜组织中表达升高,影响FLS的凋亡。本研究结果显示,PDTC和各浓度的CRME均显示出升高RA-FLS的Bax表达水平的作用,对RA-FLS的Bcl-2表达水平没有显著影响,说明CRME可能通过上调促凋亡因子Bax的作用机制促进RA-FLS的凋亡。

综上所述,CRME可抑制血管新生,通过抑制NF-κB信号通路活化减轻炎症反应,抑制FLS增殖并促进其凋亡,发挥抗RA的药理作用。

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