赵璐，冯金歌，付佳，汪亚伦，邹鹏

（沈阳医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110034）

目前结肠癌是临床上最为常见的消化系统恶性肿瘤之一，发生于直肠与乙状结肠交界处。在全球恶性肿瘤中其发病率和死亡率分别位于第四、二位［1］，是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。临床上对结肠癌的治疗方法主要采用放疗、手术及中药辅助化疗综合治疗方法。但是化疗不仅抑制肿瘤细胞的增殖并杀死肿瘤细胞，对正常细胞也会产生一定的损害。根治性手术后5年生存率仅有50%左右［2］。因此对高效低毒的天然抗肿瘤药物的需求极为迫切。大葱 （Allium fistulosum（L.）var.giganteum）属百合科，是多年生草本植物， 黄雪松［3］采用气相色谱／质谱 （GC／MS） 法鉴定挥发油中化学成分，主要含有含硫化合物、不饱和脂肪酸、萜烯类化合物等，所鉴定出来的化合物成分约占其总含量的90%。研究发现大葱油具有潜在的抗肿瘤作用［4］，大葱油能够诱导人肺癌A549细胞G2／M期阻滞，诱导细胞凋亡，同时还能够调节细胞内活性氧和线粒体膜电位［5］。Belman等［6］研究发现，与大葱油同属的洋葱和大蒜素能够抑制小鼠皮肤肿瘤细胞的增殖。但大葱油对人结肠癌细胞作用的研究较少。本实验以人结肠癌SW480细胞为研究对象，观察大葱油作用后对人结肠癌细胞增殖及侵袭的影响，并初步探讨大葱油抑制结肠癌细胞增殖及侵袭的作用机制，为进一步探讨中药复方多靶点、多方位治疗肿瘤提供理论依据，为临床治疗结肠癌寻找新药物。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 正常人结肠细胞CCD-18Co和结肠癌细胞系SW480购自美国ATCC公司。噻唑蓝 （MTT）购自美国Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清 （FBS）购自美国Gibco公司；青链霉素双抗、二甲基亚砜 （DMSO）、胰蛋白酶购自美国Sigma公司；细胞全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；抗体Cyclin D1、CDK4、CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂、ECL发光试剂购自上海碧云天生物科技有限公司；SuperScriptⅢ试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 主要仪器 CO2培养箱 （Thermo Forma SeriesⅡ）；倒置显微镜XSZ-DZ（重庆光学仪器厂）；电热恒温水箱 （中国恒科公司）；超净工作台 （北京半导体设备厂）；紫外吸收光度仪、Western blot及转膜设备 （美国 BioRad公司）；流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；液氮运输储存罐（东亚机电工贸有限公司）；显影机 （日本柯达公司）；StepOne型号荧光定量PCR仪 （美国AB Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 大葱油制备 取当地无农药污染的新鲜大葱去皮和叶，取葱白，用常压蒸馏法和水醇法提取大葱油。100℃、流通蒸汽灭菌30 min，避光保存，采用DMSO稀释成各种所需浓度备用。

1.3.2 细胞培养及分组 将CCD-18Co和SW480细胞培养于含10%FBS DMEM培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养，待细胞进入对数生长期进行实验。将细胞分为DMSO的阴性对照组和大葱油（25、 50、 100 μg／ml） 组。

1.3.3 MMT实验 将消化后的细胞制成2×104个／ml细胞悬液， 按 100μl／孔接种于 96孔板中，每孔加入20μl MTT后，37℃ 5%CO2培养箱中继续培养4 h，吸尽培养基，每孔加入150μl DMSO，水平震荡10 min后，酶标仪测定波长为490 nm的吸光度值。以吸光度值代表细胞数目。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期分布 将SW480细胞以5×106个／ml接种于24孔板中，常规培养24 h，换实验用培养基 （分组同上），48 h后，用冰PBS洗涤2次、离心收集细胞。用预冷70%乙醇固定4℃过夜，PBS洗涤3次后加入1 mg／ml PI染液，室温避光孵育30 min后，以5×106个／ml上样流式细胞仪，检测细胞周期分布。

1.3.5 Annexin V-FITC／PI双标检测细胞凋亡采用DMSO和50、100μg／ml大葱油处理 SW480细胞24 h，消化离心，收集各组细胞，用0.01 mol／L PBS （pH 7.3） 轻洗2 次； 1 000 r／min 离心5 min，弃上清，用500μl膜联蛋白结合缓冲液重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC避光染色10 min，再加入10μl PI于室温下避光孵育5 min；上流式细胞仪检测荧光强度，分析细胞凋亡百分率。

1.3.6 实时荧光定量PCR检测细胞Cyclin D1、CDK4、 CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、MMP9、LIMK1和Cofilin基因表达 收集各组处理 24 h后的细胞，4℃ 500 r／min离心3 min收集细胞，按 TRizol试剂说明书抽提总RNA，按SuperScriptⅢ试剂盒说明书合成第一条链cDNA，以合成的cDNA为模版，进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR中的引物序列见表1。反应参数：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃ 15 s循环40次，60℃延伸1 min。

表1 实时荧光定量PCR中的引物序列

1.3.7 Western blot法检测细胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3蛋白的表达 将SW480细胞以5×106个／ml接种于24孔板中，常规培养24 h，换实验用培养基 （分组同上），48 h后，4℃ 500 r／min离心3 min收集细胞，用PBS洗涤2次。然后按照细胞全蛋白提取试剂盒说明书进行全蛋白提取，并以Bradford法测定蛋白浓度后-70℃保存备用。用15%SDS-PAGE分离40μg全蛋白，电转至NC膜，用TBST配置5%的脱脂奶粉封闭1 h。加入1∶2 000稀释的抗体 Cyclin D1、 CDK4、 CDK6、Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、 MMP2、MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、 Cofilinp-Ser3，4℃孵育过夜，然后取出NC膜，TBST室温洗3次，每次5 min。加入二抗室温孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。在暗室里，按照1∶1的比例混合发光底物A、B液。取出膜放入Bio-Rad显像仪。保存图片并使用Quantity One分析软件对图像灰度进行分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大葱油对结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用

MTT法检测大葱油对CCD-18Co和SW480细胞增殖的影响，结果显示，与正常人结肠细胞CCD-18Co组结果相比，大葱油对SW480细胞的生长具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性 （P＜0.01）（图1A、B）。大葱油作用SW480细胞24 h的最佳药物浓度为 100 μg／ml。 100 μg／ml大葱油作用于CCD-18Co和SW480细胞24 h，结果显示大葱油对SW480细胞组的细胞抑制率显著高于CCD-18Co组 （P＜0.01） （图 1C）。

2.2 大葱油作用后SW480细胞周期受阻 流式细胞仪检测结果所示，与对照组相比，不同浓度的大葱油作用24 h后，SW480细胞停滞在G2／M期（P＜0.01），见图2A。并且，大葱油的作用浓度越高，阻滞在G2／M期的细胞比例越高。结果显示，大葱油诱导SW480细胞的阻滞在G2／M期。同时，实时荧光定量PCR和Western blot法结果见图2B、C，分别采用DMSO和25、50、100μg／ml大葱油作用SW480细胞24 h后，分别检测周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6的基因及蛋白表达，大葱油能够抑制Cyclin D1、CDK4和CDK6的基因及蛋白表达，且随着大葱油浓度的升高抑制作用逐渐显著。

2.3 Annexin V-FITC／PI双染检测大葱油对SW480细胞凋亡的影响 Annexin V-FITC／PI双染检测结果显示，随着大葱油作用浓度的增加，SW480细胞凋亡率显著升高，浓度越高，诱导细胞凋亡的作用越明显，见图3A。同时，实时荧光定量PCR和Western blot法检测结果见图3B、C所示，分别采用DMSO和25、50、100μg／ml大葱油作用SW480细胞24 h后，分别检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因及蛋白表达，大葱油能够抑制Bcl-2的基因及蛋白表达，促进Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因及蛋白表达，且随着大葱油浓度的提高抑制和促进作用逐渐显著，且呈浓度依赖性。

图1 大葱油作用对结肠癌SW480细胞增殖能力的影响

2.4 大葱油对SW480细胞侵袭的影响 分别采用DMSO和25、50、100μg／mL大葱油作用 SW480细胞24 h后，分别检测与细胞侵袭相关蛋白MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3的基因及蛋白表达。实时荧光定量PCR结果显示，与DMSO组比较，随着给药浓度的逐渐增加，MMP2、MMP9的基因表达量明显受到抑制 （P＜0.01）， 而LIMK1、Cofilin的基因的表达量差异无统计学意义。Western blot结果显示，与DMSO组比较，随着大葱油浓度的逐渐增加，MMP2、 MMP9、 LIMK1p-Thr508、 Cofilinp-Ser3蛋白表达量明显受到抑制 （P＜0.01）；LIMK1和 Cofilin的磷酸化水平显著降低，而LIMK1和Cofilin蛋白表达量没有显著下降，大葱油抑制LIMK1、Cofilin磷酸化。见图4。

3 讨论

随着经济的发展，人们生活习惯和饮食结构的改变，增加了结肠癌的患病风险，目前其发病率和致死率在国内外均有上升的趋势，早期结肠癌5年的生存率大约为90%，但是一旦发生侵袭转移其生存率仅为15%，尽管近些年来研发出许多早期诊断和治疗的方法，但是这种现象没有得到改善，而且出现侵袭转移和化疗耐药是治疗失败的主要原因，严重威胁人类健康［7］。因此，寻找能预防和治疗结肠癌的新药非常必要。

图2 大葱油对SW480细胞周期的影响

图3 大葱油作用对结肠癌SW480细胞凋亡的影响

图4 大葱油对SW480细胞侵袭的影响

近年来，人们致力于寻求抑制肿瘤发生发展和转移侵袭的天然药物，因为其可降低化疗药物的毒副作用，增强化疗药物的抗癌作用。实验研究发现，鲜大葱可能通过降低胃液中亚硝酸盐含量，从而降低患胃癌风险［8］，但大葱油对结肠癌的作用尚未引起人们的高度重视。

本研究结果表明大葱油可抑制结肠癌细胞SW480的增殖，而这种抑制作用是通过停滞细胞周期和诱导细胞凋亡来实现的。大葱油处理的SW480细胞中，与细胞周期进程相关蛋白 （Cyclin D1、CDK4和 CDK6）和与细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、 Bax、 Caspase-9和Caspase-3） 表达呈现显著变化，结果提示，大葱油的抗癌效果是通过对一些肿瘤生物学途径如细胞周期进程和细胞凋亡途径等发挥多重作用来实现的。

肿瘤转移是一个主动过程，癌细胞通过运动穿破宿主结缔组织、血管、淋巴管壁，从而进入体液循环，再穿破结缔组织、血管、淋巴管壁在靶器官定位形成转移灶。MMPs是一类能降解细胞外基质和血管基底膜的蛋白水解酶，还能够调节血管生长因子的作用，所以在肿瘤生长转移和血管生成的过程中发挥重要作用。MMP2和MMP9能够特异性地降解细胞外基质和基底膜的主要成分Ⅳ型胶原，抑制肿瘤细胞的转移［9-10］。此外，LIM激酶 （LIMK）能够参与细胞周期进展、肿瘤新生血管生成及肿瘤细胞侵袭、迁移、增殖等多种行为［11-12］。 丝切蛋白 （Cofilin） 在多种人类肿瘤中高表达，尤其在高侵袭性肿瘤中高表达，参与肿瘤细胞侵袭、转移，提示其可作为预测恶性肿瘤侵袭、转移的潜在标记物［13］。本文检测了大葱油对结肠癌细胞SW480侵袭、迁移能力的影响，当SW480细胞采用不同浓度的大葱油处理后，与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关的蛋白表达都会显著下调，提示大葱油能够抑制SW480细胞的侵袭和转移。

综上所述，大葱油对人结肠癌SW480细胞有显著的抗肿瘤活性，主要通过阻滞G2／M期，抑制结肠癌细胞周期进程，抑制细胞增殖，同时抑制SW480细胞的转移侵袭能力。因此，大葱油可以作为治疗人结肠癌的有效药物，同时为开发一种抗肿瘤药物或药物前体提供一定参考。本研究也将继续深入研究大葱油抗结肠癌的作用机制，为靶向防治结肠癌的药物和高效低毒的创新药物研发提供科学依据。