段庆梓，张玉，王巍，尚柯，梁恒兴

（成都市食品药品检验研究院，四川成都610045）

基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的目标基因检测已成为动物源性鉴别的主要方法[1-2]，目前常见的动物源性成分检测已形成了独立的PCR方法标准[3-4]，并广泛应用于动物成分的检测中。近年来，海狸鼠（Myocastor coypus）养殖在我国各地逐渐兴起，主要由于其附加产品具有较高的经济价值。海狸鼠的毛皮可作为皮草的原材料，脂肪组织可以用于化妆品原料，尾筋可用于制作手术缝合线[5]。但其肉质并未有明确的用途，对其肉质的后期处理也没有可溯源的检测方法。

为了避免海狸鼠肉违规流入市场，本研究拟建立海狸鼠成分的PCR检测方法，用于检测肉及肉制品中是否掺杂有海狸鼠成分。本方法主要通过海狸鼠与其他常见物种的细胞色素b（cyto chromed，Cytb）基因比对，寻找碱基差异序列设计海狸鼠特异性引物，并通过优化反应参数，建立海狸鼠源性检测的PCR方法，为海狸鼠源性成分的鉴别提供了分子检测依据。

1 材料

1.1 样品

海狸鼠、竹鼠：河南安阳海狸鼠养殖场；大鼠、小鼠、豚鼠：成都市食品药品检验研究院药理室；其他常见肉样（猪、牛、羊、鸡、鸭、兔）：市购。

1.2 试剂

细胞/组织基因组DNA提取试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司；2×PCR预混液：TAKARA公司；DNA分子量标记：天根生化科技（北京）有限公司；海狸鼠特异性引物：由生工生物工程（上海）有限公司合成；无水乙醇：分析纯，广东光华科技股份有限公司；水为灭菌的去离子水。

1.3 仪器与设备

BSA223S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；5427R低温离心机：德国Eppendorf公司；DK-420电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；P330核酸蛋白仪：德国IMPLEN公司；Veriti 96-well PCR仪：Thermo Fisher Scientific公司；Power Pac Basic电泳仪：美国Bio-Rad公司；Gel Doc310凝胶成像仪：美国UVP公司。

2 方法

2.1 海狸鼠引物设计

线粒体基因由于具有分子量小、结构简单、进化速率快、多态性丰富、无重组和遵循母系遗传等特点，是一个比较理想的用于检测的靶基因，且在动物的组织细胞中均含有大量线粒体[6-7]，因此本研究选取线粒体的细胞色素b（Cytb）基因作为目标检测的靶基因。在 GenBank数据库中查找海狸鼠（AF422919.1、EU544663.1、LC257678.1、LC257679.1）、竹鼠（NC_039-104.1）、大鼠（EU349782.1）、小鼠（LC325158.1）、豚鼠（HM447187.1）及猪（AB015079.1）、牛（MH714782.1）、山羊（KY662383.1）、绵羊（KY662385.1）、鸡（AF028-795.1）、鸭（EU009397.1）和兔（U07566.1）的 Cytb基因序列，并使用MegAlign软件进行物种间的序列比对，在海狸鼠与其他物种的DNA碱基差异区域设计特异性引物。

2.2 样品前处理及DNA提取

分别取不同物种样品的肌肉组织100 mg置于2 mL离心管中，依据细胞/组织基因组提取试剂盒操作说明进行DNA提取，并测定DNA的浓度和纯度。将得到的各物种DNA浓度稀释至20 μmol/L用于PCR反应。

2.3 PCR方法的建立

通过对特异性引物的不同退火温度（52、54、56、58 ℃）和 PCR反应不同循环数（20、25、30、35）的考察，来确定PCR反应体系和反应程序。

2.4 琼脂糖凝胶电泳

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（胶浓度为2%），电泳条件为6 V/cm，电泳时间为30 min。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶置于成像仪下照相并保存照片。

2.5 检出限的确定

为确定海狸鼠源性鉴别PCR反应的检出限，设计检出限样品的制备：分别以鸡肉、兔肉为基质，制备不同海狸鼠肉质量比（50%、10%、1%、0.1%、0.01%）的混合肉样。以50%质量比的混合肉样为例，取200 mg海狸鼠肉（质量比为100%）加入到200 mg鸡肉或兔肉中，充分均质混匀，即得。10%、1%，0.1%和0.01%的混合肉样同法制备。分别取100 mg的不同质量比混合肉样进行DNA提取和海狸鼠源性成分的PCR扩增。

2.6 方法的特异性考察

以海狸鼠为阳性对照，选取常见的鼠类（竹鼠、大鼠、小鼠、豚鼠）和物种（猪、牛、羊、鸡、鸭、兔）作为阴性对照，用灭菌的去离子水作为空白对照，进行PCR反应，来考察海狸鼠源性PCR反应的特异性。

3 结果与分析

3.1 海狸鼠特异性引物序列

海狸鼠与其他物种的Cytb基因序列比对结果见图1。

由图1，确定海狸鼠特异性引物为，上游引物F：5'-TGTAT GCTTA GCCCT ACAAA TCAC-3'，下游引物R：5'-GCATT AGTAT GAATA ATAGT-3'。该引物对扩增的海狸鼠片段长度约为599 bp。

3.2 特异性引物退火温度的确定

根据特异性引物碱基序列估算引物的退火温度，分别设置退火温度为52℃～58℃进行PCR反应，结果如图2所示。

52℃～58℃均有海狸鼠源性的PCR扩增，当退火温度为58℃时，PCR产物丰度与其他温度相比较弱，而52℃～56℃的扩增条带亮度较为一致，依据退火温度越高，引物结合的特异性越好的原则，选择56℃为特异性引物的最佳退火温度。

3.3 PCR循环数的确定

设定PCR反应循环数分别为20、25、30和35个循环，反应结果如图3所示。

图1 海狸鼠与其他物种的Cytb基因序列比对Fig.1 Sequenc ealignmnet of Cytb between Myocastor coypus and other species

图2 不同退火温度考察Fig.2 Investigation of different annealing temperatures

由图3可知，在设定的20～35个循环之间都有扩增条带，且随着循环数的增加呈逐步变亮的趋势，但30个循环和35个循环的扩增亮度基本一致，无明显差异，因此，为节约反应时间设定该PCR反应的循环数为30个循环。

3.4 PCR反应体系的确定

图3 不同反应循环数考察Fig.3 Investigation of different reaction cycles

依据特异性引物的退火温度和反应循环数，PCR反应的总体积为25 μL：包括2×PCR混合液12.5 μL、正、反向引物（10 μmol/L）各 0.4 μL、模板 DNA 2 μL，灭菌去离子水补足25 μL。PCR反应程序为：94℃5 min，30个循环（94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s），72℃5 min。

3.5 PCR检出限的确定

对海狸鼠肉质量比为100%、10%、1%、0.1%和0.01%的混合肉样分别进行PCR反应，结果如图4所示。

图4 海狸鼠PCR反应检出限结果Fig.4 PCR result of Myocastor coypus detection limit reaction

由图4可知，在鸡肉和兔肉中添加0.1%的海狸鼠肉时即被检出，PCR条带较弱，但随着海狸鼠肉比例的增加，PCR条带的亮度也逐渐变亮，与添加量的变化呈正相关。该结果表明，所建立的海狸鼠PCR反应所能检出海狸鼠源性的检出限为0.1%，反应体系的灵敏度较高。

3.6 PCR反应的特异性验证

分别取其他常见鼠类（竹鼠、大鼠、小鼠、豚鼠）和常见物种（猪、牛、羊、鸡、鸭）进行PCR反应的特异性试验，结果如图5所示。

图5 海狸鼠PCR反应特异性结果Fig.5 PCR result of Myocastor coypus specificity reaction

由图5可知，PCR反应仅对海狸鼠样品有目的条带的扩增，对其他常见鼠类和动物源性无扩增条带。该结果表明所建立的海狸鼠PCR反应特异性较好，符合PCR反应的预期要求。

4 结论

本研究依据常用动物源性成分特异性PCR方法的设计原理[8-10]，将海狸鼠与其他常见物种Cytb基因进行序列比对，在碱基差异区域设计了特异性引物，并用过参数优化和相关考察建立了海狸鼠源性检测的PCR反应体系，该方法能够对海狸鼠扩增大小为599 bp的条带，而对其他物种无扩增，因此得以鉴别。通过进行海狸鼠与鸡肉、兔肉不同比例混合肉样的方法研究，该体系对海狸鼠源性的检测低限可达到0.1%。同时，建立的海狸鼠特异性PCR鉴别体系对其他常见物种有较好的方法特异性。

综上所述，本研究建立的海狸鼠源性成分的PCR检测方法，能够完成对海狸鼠源性成分的专属性检测，且方法准确、快速，操作简便，能够满足海狸鼠源性成分检测的市场需求，为检验机构或企业提供一定的技术支撑。