（漯河食品职业学院食品工程系，河南漯河462000）

洋葱，人们常称为球葱、葱头、玉葱或者皮牙子，是生长周期两年的草本科植物，是一种性价比非常高的蔬菜，也是调味料的主要成分[1]。洋葱中的营养成分含量非常可观，钾、维生素C、叶酸、锌、硒、植物多酚及纤维质等常规营养物质与他蔬菜相比含量较高，更令科学家惊喜的是槲皮素和前列腺素A这两种生理活性物质在洋葱中的含量也比较高，这两种物质使洋葱具有了许多独特的保健功能[2]。

洋葱含有大量的多酚类化合物，对其的提取研究目前已经出现的有超高压提取法、乙醇浸提法、微波辅助提取法等，但用超声波辅助提取洋葱多酚的方法还少有报道。本研究拟考察通过单因素试验分别探讨超声功率、超声处理时间、乙醇浓度、固液比4个单因素对洋葱多酚得率的影响；在单因素试验基础上，依据Box-Benhnken中心组合试验设计原理[3]，设计四因素三水平的响应面法分析试验，确定超声辅助提取洋葱多酚的最佳提取条件。并对得到的多酚物质进行体外抗氧化活性分析，对洋葱的综合利用和开发提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜紫皮洋葱：漯河千盛购物广场；

福林酚试剂：天津华特化科技有限责任公司；没食子酸、三羟基氨基甲烷（Tris）：美国Sigma公司；无水碳酸钠、无水乙醇、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、邻苯三酚以上试剂均为分析纯。

NCGF无水碳恒温干燥箱：南京鑫长江制药设备有限公司；WN500万用粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；FA1004电子分析天平：沈阳龙腾电子有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器：上海天实机电设备有限公司；TG16-W微量高速台式离心机：张家港新华化工机械有限公司；WFZUV-2800AH紫外可见分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线

准确称取没食子酸标准品0.1 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得到浓度为1 mg/mL的没食子酸母液。准确吸取 0、1、2、3、4、5 mL 标准液于 100 mL 容量瓶中，加入蒸馏水定容，得到 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的没食子酸标准液，分别加入不同浓度的没食子酸标准液1 mL于4 mL的离心管中，加入1 mL 0.25 mol/L的福林酚试剂，混合均匀静置3 min，加入2 mL15%Na2CO3混合，静置30 min，3 500 r/min离心3 min，760 nm处测吸光值。每组试验平行测定3次，取平均值。根据没食子酸含量及对应的吸光度绘制出没食子酸标准曲线，得到的线性回归方程为：y=28.443x+0.0677 9，r2=0.999 6。

1.2.2 洋葱多酚的提取

把6 kg紫皮洋葱用自来水冲洗干净，去皮，切块，装盘后放入电热鼓风恒温干燥箱50℃恒温干燥60 h。使用WN500型万用粉碎机粉碎，过60目筛备用。

洋葱中多酚含量的提取方法采用Folin-Ciocalteu试剂法[4]。1mL经超声处理后的样品液与1mL0.25 mol/L Folin试剂混合均匀，放置3 min，加入15%的Na2CO3溶液2 mL，再次混合、放置30 min，试样经3500 r/min的高速离心机离心3 min，在760 nm处测吸光度。洋葱多酚得率照下式计算：

式中：W为多酚得率，mg/g；C为多酚质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为洋葱粉末质量，g。

1.2.3 多酚提取试验设计

1.2.3.1 单因素试验设计

为系统地考察超声处理对洋葱多酚得率的水平高低，分别选择超声功率（200、250、300、350、400 W）、超声处理时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%）和固液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）进行单因素试验。

1.2.3.2 响应面试验设计

在单因素试验基础上进行了响应面分析，选取超声功率、超声处理时间、乙醇浓度和固液比为4因子，每个因素选择包括最佳水平在内的3水平，进行Box-Behnken中心组合试验。通过响应面分析结果找到最优的超声处理参数。因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4 体外抗氧化活性试验

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性的测定

取2 mL的样品溶液和2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）放入试管中，充分搅拌后在阴凉避光处放置30 min，在517 nm处测定其吸光度A1。同样方法测定2 mL无水乙醇和2 mL样品溶液充分混匀后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸馏水的吸光度A0，同时用VC标准品作为对照[5]。

DPPH 自由基清除率/%=[1－（A1－A2）/A0]×100

1.2.4.2 羟自由基清除活性测定

取不同浓度的粗多酚样品溶液1 mL分别加入到试管中，分别依次加入1 mL 8 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 8 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1 mL 8 mmol/L H2O2[6]。充分混匀后静置1 h，在510 nm处测定吸光值A2。同样方法，用蒸馏水替代样品测得吸光度A0；用蒸馏水替代H2O2测得吸光度A1。同时用VC标准品作为对照。

羟自由基清除率/%=[1－（A2－A1）/A0]×100

1.2.4.3 超氧阴离子自由基清除活性测定

取pH值为8.2质量浓度为50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液4.5 mL，放入25℃恒温水浴中保持30 min，分别加入0.4 mL质量浓度为25 mmol/L的邻苯三酚溶液和1 mL样品溶液，搅拌均匀后在25℃恒温水浴中放置4 min，加入1 mL质量浓度为8 mmol/L的盐酸溶液摇匀。在波长320 nm处测定吸光度记为A1，同法以1 mL蒸馏水代替样品测得吸光度记为A0[7]。同时用VC标准品作为对照。

超氧阴离子自由基清除率/%=（1－A1/A0）×100

1.3 数据分析

采用Design-Expert 8.0.6软件响应面试验设计及分析，其余运用Microsoft excel软件进行数据处理[8]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对洋葱多酚得率的影响

超声功率对洋葱多酚得率的影响见图1。

图1 超声功率对洋葱多酚得率的影响Fig.1 The impact of ultrasonic power on onion polyphenols extract single factor test results

从图1中可以发现超声处理对洋葱多酚得率影响比较显著，在超声功率为350 W处，洋葱多酚物质提取率最大，为10.33 mg/g。当超声功率大于350 W后，多酚得率开始下降。研究表明，超声波的空化作用和机械作用[9]可以起到破坏植物的细胞结构、加快分子的运动速率的作用，并且超声功率越增强，植物细胞结构破坏得越严重，可以促使细胞内多酚物质的析出，最终导致多酚得率的降低。因此根据试验数据进行分析的结果，超声功率以350 W最为合适。

2.1.2 超声处理时间对洋葱多酚得率的影响

超声处理时间对洋葱多酚得率的影响见图2。

图2 超声处理时间对洋葱多酚得率的影响Fig.2 The impact of ultrasonic processing time on onion polyphenols extract single factor test results

从图2中可以看出，在超声处理时间为0.5 h～1 h内，洋葱多酚提取率增幅很大，并且在处理时间为1 h处，洋葱多酚得率最大，为10.154 mg/g。但是随着提取时间的增加，洋葱多酚得率却逐渐减小，差异显著。这一现象表明在一定的超声处理时间段内，时间越长越有利于多酚物质的溶出；但是这个时间段之后，洋葱多酚得率开始减小。查阅文献发现超声波热效应会导致洋葱中部分不太稳定的多酚分解转化为其他物质，故在测量时会使得吸光度减小，最终导致计算得到的洋葱多酚得率数值变小。不过也可能是因为长时间的超声处理导致某些亲醇类的物质溶出，这也会降低洋葱多酚的提取率。同时超声处理时间过长，浸出的洋葱多酚物质可能在溶液内被氧化[10]，这也会对提取率造成一定的影响。最后，在实际操作中考虑到超声处理时间的延长，会导致能耗和成本的增加，因此选择超声处理时间为1 h较为合适。

2.1.3 乙醇浓度对洋葱中多酚得率的影响

乙醇浓度对洋葱中多酚得率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对洋葱多酚得率的影响Fig.3 Ethanol volume fraction of onion polyphenols extraction effect of singe factor test results

从图3中可以发现，当乙醇浓度在20%～80%范围内，洋葱中的多酚得率随着乙醇浓度的变大而增加，差异显著，在乙醇浓度为80%时，洋葱中的多酚得率达到最大值为10.178 mg/g。但是将乙醇浓度扩大至100%时，洋葱多酚得率却反而下降至7.76 mg/g。众所周知，多酚类物质经常与一些大分子物质通过化学键例如氢键形成复合物，当乙醇浓度较低、水分含量较高时，对氢键的破坏作用较小，这会造成多酚类物质不易溶出，最终使得通过超声波辅助提取得到洋葱中的多酚提取率不太乐观。但是当乙醇浓度继续增加，一些脂类、色素等杂质就会溶解[11]，这些成分会与多酚物质竞争，同乙醇水分子结合，最终导致多酚活性物质的溶解度降低，对多酚的提取率会造成一定的影响。因此选择乙醇浓度为80%较为合适。

2.1.4 固液比对洋葱多酚得率的影响

固液比对洋葱多酚得率的影响见图4。

图4 固液比对洋葱多酚得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of onion polyphenol

从图 4中可以发现，固液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）范围内，洋葱多酚得率随着液体体积的变大而减小，差异明显。当固液比大于1∶20（g/mL），洋葱多酚的得率随着液体体积的增大而增大，并且当固液比为1 ∶40（g/mL）时，洋葱多酚得率最大为11.737 mg/g。之后继续增大到固液比1∶50（g/mL），洋葱的多酚得率不升反降。因而选择固液比为1∶40（g/mL）较为合适。

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 回归方程的建立与分析

结合单因素试验的结果，以超声功率、超声时间、乙醇浓度和固液比为自变量，以洋葱多酚物质的得率为响应值，进行四因素三水平响应面分析。试验多次，使用Design Expert8.0.6将数据分析，其响应面试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 Box-Benhnken试验设计及响应结果Table 2 Box-Benhnken design and response results values

续表2 Box-Benhnken试验设计及响应结果Continue table 2 Box-Benhnken design and response results values

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表3可以看出，该回归模型P＜0.000 1，方程模型极显著。失拟项P=0.516 9＞0.05不显著；该模型的确定系数R2=0.946 5，校正确定系数R2Adj=0.892 9，变异系数CV=5.14%，以上参数说明该模型拟合性好，试验误差小。根据回归系数，得到洋葱多酚得率的二次多元回归方程为：

Y=12.26-0.52A-0.69B＋0.94C-0.36D＋1.71AB-0.15AC-0.05AD＋0.85BC＋0.63BD-0.92CD-1.21A2-1.63B2-0.98C2-1.14D2

由表3中方差结果可知，超声提取洋葱多酚的工艺参数中，对多酚得率影响的大小顺序为：C固液比＞B超声时间＞A超声功率＞D乙醇浓度。其中C固液比、B超声时间和A超声功率达到极显著水平，D乙醇浓度达到显著水平。考察各因素间交互作用，AB、BC、BD、CD存在交互作用，其中AB、BC和CD达到极显著水平，BD乙醇浓度达到显著水平。

2.2.2 两因素交互作用响应面分析

根根据回归方程绘制响应面图，通过观察响应面的变化情况和稀疏程度可直观地反映各因素相互作用对多洋葱多酚得率的影响，结果如图5所示。

图5 两因素交互作用对多酚得率的响应面图Fig.5 Response surface diagram of interaction of two factors on polyphenol yield

当响应面的坡度越陡峭、等高线越密集而呈现扁圆形或马鞍形时，则表示两因子交互作用越显著。通过对比，图 5（a）、（d）、（e）、（f）这 3 个图的曲面较陡峭、等高线较密集，图 5（b）和（c）次之。表明超声功率（A）和超声时间（B）、超声时间（B）和固液比（C）、超声时间（B）和乙醇浓度（D）、固液比（C）和乙醇浓度（D）的交互作用显著，与表3分析结果一致。

2.2.3 最佳条件的确定和模型的验证

运用Design-Expert8.0.6软件对洋葱多酚提取率的二次多项模型实行了优化，选出超声提取洋葱多酚的最佳工艺参数：超声功率321.48 W、超声时间0.77 h、固液比1∶45.57（g/mL）、乙醇浓度75%，预测洋葱多酚得率为12.9161 mg/g。考虑实际情况和可操作性，将洋葱多酚的最优的工艺参数设定为：超声功率320 W、超声时间0.8 h、固液比1∶45（g/mL）、乙醇浓度75%，在此条件下得到的得率为12.77 mg/g，与预测值接近，说明了该模型可靠。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 DPPH自由基清除作用

洋葱多酚和VC对DPPH自由基清除率的影响见图6。

图6 洋葱多酚和VC对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effect of onion polyphenol and VCon DPPH radical scavenging rate

当洋葱多酚的浓度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之间时，随着洋葱中多酚浓度的不断增加，其对DPPH自由基的清除率呈上升趋势。继续提高多酚浓度时，其对DPPH自由基的清除率不升反降。当洋葱多酚的浓度为0.3 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到86.2%。

2.3.2 洋葱多酚对羟自由基清除活性分析

洋葱多酚和VC对对羟自由基清除率的影响见图7。

从图7中可以看出，当洋葱中多酚的浓度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之间时，随着洋葱中多酚浓度的增加，对羟自由基的清除率也不断提高，当洋葱多酚的浓度为0.3 mg/mL时，对羟自由基的清除率达到86.4%。

图7 洋葱多酚和VC对羟自由基清除率的影响Fig.7 Effect of onion polyphenol and VCon hydroxyl radical scavenging rate

2.3.3 洋葱多酚对超氧阴离子清除活性分析

洋葱多酚和VC对超氧阴离子清除率的影响见图8。

图8 洋葱多酚和VC对超氧阴离子清除率的影响Fig.8 Effect of onion polyphenol and VCon superoxide anion scavenging rate

从图8中可以看出，当洋葱中多酚浓度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之间时，随着多酚浓度的增加，对超氧阴因子的清除能力也逐渐增强，当洋葱中多酚浓度为0.3 mg/mL时，清除率最高，达到80.6%。

3 结论

本文以紫皮洋葱为原料，对超声辅助提取洋葱多酚的工艺进行了研究。采用响应面分析法，优化了超声提取洋葱多酚的工艺参数。优化得到的洋葱多酚提取工艺参数为：超声功率320 W、超声时间0.8 h、固液比1∶45（g/mL）、乙醇浓度75%。此条件下，洋葱多酚的得率为12.77 mg/g。体外抗氧化活性研究结果表明，在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL的浓度范围内，洋葱多酚对DPPH·、羟基自由基、超氧阴离子自由基具有较强的清除性，表明洋葱多酚具有良好的体外抗氧化活性，但洋葱多酚的抗氧化能力比VC弱。