蔡毅，孙振华，马雯芳，吴剑丽，钟珍林

（广西中医药大学，广西南宁530200）

桑椹是桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥果穗[1]。早在《尔雅》，《本草纲目》上便有记载，其鲜果可直接食用，晾晒干燥可做药用，是历史悠久的药食两用品，其性寒，有滋阴养血、生津、润肠之功，治疗血虚精亏，须发早白，伤津口渴之效[2]。现代药理学研究表明，其具有抗氧化、抑菌、免疫调节、降血糖、降血脂等药理作用[3-4]。近年对桑椹抗氧化作用的研究主要集中在其酚类成分的抗氧化活性评价[5-6]，未见有以抗氧化作用为评价指标，对桑椹抗氧化活性成分群提取工艺优化相关研究的报道。本文充分考虑多种成分的提取效率，以药效为考察指标，通过正交试验设计优化活性成分群的提取工艺，并对不同产地、不同流通地、采摘与市售桑椹的抗氧化活性进行评价，为相关产品的研究开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

5810R离心机：德国Eppendorf公司；DP5系列超纯水仪：法国密里博公司；UV 2600紫外可见光分光光度计：日本岛津公司。

DPPH试剂（批号：6 KCYN-LT）：日本东京化成工业株式会社；甲醇、乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

从全国各地采集桑椹药材30批，经广西中医药大学滕建北教授鉴定为桑科植物桑的干燥成熟果穗。从广西、四川等桑椹主产区采摘药材15批，从四川、江苏等省区购买市售桑椹药材15批。药材信息表见表1，全部批次样品经干燥处理后粉碎，过24目筛，备用。

表1 桑椹药材信息表Table 1 Information of Mori Fructus

续表1 桑椹药材信息表Continue table 1 Information of Mori Fructus

1.2 方法

1.2.1 绘制标准曲线

精密称取DPPH试剂19.76 mg，置于100 mL容量瓶中，加90%甲醇至刻度，配置成0.5 mmol/L的DPPH溶液，再依次稀释成0.4、0.3、0.2、0.1 mmol/L的溶液，以90%甲醇为空白对照，在517 nm处测定，得到以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标的回归方程。

1.2.2 DPPH溶液的制备

精密称取DPPH试剂39.45 mg，配置成0.4 mmol/L的DPPH溶液，备用。

1.2.3 单因素考察

1.2.3.1 提取溶剂考察

精密称取桑椹药材（S10）9份，各0.3 g，分别精密加入50%甲醇、50%乙醇、纯水各20 mL，超声提取（400 W，40 kHz）30 min，滤过，得到提取原液。取过滤原液逐步稀释，得到原液，以及 1/2、1/4、1/6、1/8、1/16、1/32、1/64倍原液浓度，8组不同浓度的供试品溶液。

分别精密移取1 mL提取溶剂，加入到3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液中，混匀，以90%甲醇为空白参比，测定吸光度值A0。

分别精密移取1 mL供试品溶液加入到3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混匀，避光反应30 min，以90%甲醇为空白参比，测定吸光度值A1。

分别取1 mL供试品溶液加入到3 mL 90%甲醇中，混匀，以90%甲醇为空白参比，测定吸光度值A2。

1.2.3.2 乙醇浓度考察

精密称取桑椹药材（S10），各0.3 g，加入30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇各20 mL，超声提取（400 W，40 kHz）30 min，滤过，分别测定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0统计软件计算IC50。

1.2.3.3 提取时间考察

精密称取桑椹药材（S10），各0.3 g，分别以超声提取处理 20、30、40 min，分别测定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0统计软件计算IC50。

1.2.3.4 溶剂用量考察

精密称取桑椹药材（S10），各0.3 g，分别精密加入50%乙醇 20、25、30 mL，分别测定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0统计软件计算IC50。

1.2.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上选择优化后的试验因素，以IC50值为评价指标，按照L9（34）正交表进行试验优化各因素水平，考察乙醇浓度、溶剂用量、提取时间对半数清除率的影响，以抗氧化效应为考察指标，确定最佳提取工艺条件，因素-水平表见表2。

表2 正交试验因素-水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 绘制标准曲线

以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，得到回归方程，Y=9.441 57X+0.113 283，r2=0.999 16，表明在0.1 mmol/L～0.5 mmol/L的浓度范围内，浓度与吸光度呈良好线性关系，线性关系图见图1。

图1 线性关系图Fig.1 Linear diagram

2.1.2 提取溶剂考察

提取溶剂考察表结果见表3。

由表3可知，乙醇相较于甲醇和水提取液IC50值更小，抗氧化能力更优，且考虑乙醇无毒性，用乙醇提取更为安全，因此，采用乙醇作为提取溶剂。

表3 提取溶剂考察表Table 3 Solvent extraction research

2.1.3 乙醇浓度考察

乙醇浓度考察表见表4。

表4 乙醇浓度考察表Table 4 Ethanol concentration research

由表4可知，50%乙醇提取液IC50值最小，为0.078，因此采用50%乙醇作为提取溶剂。

2.1.4 提取时间考察

提取时间考察结果见表5。

表5 提取时间考察表Table 5 Extracting time research

由表5可知超声提取30 min的IC50较小，抗氧化能力较强，因此提取时间选定为30 min。

2.1.5 溶剂用量考察

溶剂用量考察结果见表6。

表6 溶剂用量考察表Table 6 Solvent dosage research

由表6可知，当溶剂用量为20 mL时IC50值较小，抗氧化能力较优，因此溶剂用量为20 mL。

2.2 正交优化结果与分析

综合单因素试验结果，按照1.2.4项下正交试验设计，正交试验设计及结果分析见表7，方差分析结果见表8。

表8 方差分析结果Table 8 Variance analysis

由表7、表8可知，试验最佳工艺组合为A2B1C2，K值最优为A2B1C1；正交试验统计结果分析表明，A（乙醇浓度）、B（溶剂用量）两个因素对桑椹羟基自由基半数清除率IC50有显著影响，且各因素影响的程度依次为：B（溶剂用量）＞A（乙醇浓度）＞C（提取时间）。

为进一步确定最佳提取工艺，比较直观分析所得提取工艺与正交试验分析得到的桑椹抗氧化活性成分群最佳提取工艺，进行验证性试验，结果见表9。

表9 最佳工艺的验证试验（n=3）Table 9 Optimum process validation research

验证性试验结果表明，工艺组合A2B1C2的羟基自由基半数清除率IC50值更低，即抗氧化能力更强，确定最佳提取工艺为50%乙醇20 mL超声提取30 min。

2.3 不同批次桑椹抗氧化活性测定

分别称取各批次桑椹药材（50目）各0.3 g，精密称定，精密加入50%乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液1 mL与3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混匀，避光反应30 min，以90%甲醇为空白参比，在517 nm处分别测定 A0、A1、A2，并计算 IC50，30 批次不同产地、不同流通地、采摘与市售不同药材羟基自由基半数清除率IC50在0.041～0.456之间，抗氧化作用良好，测定结果见表10。

表10 不同批次桑椹药材抗氧化作用测定结果（n=3）Table 10 Antioxidant activity determination results of all batches of Mori Fructus

3 结论

人体的自由基是不断地产生和消除的过程，衰老自由基理论认为自由基攻击细胞成分，引发衰老的一系列损伤，自由基与生物体的寿命存在强相关关系[8]。DPPH是一种稳定的氮中心自由基，在溶液中显深紫色，其可以捕获氧化剂的自由基，与自身孤电子配对，使颜色变黄、变浅，且变化程度与自由基清除率呈线性关系，是评价天然抗氧化剂的一种常用方法[9-10]。

本文以桑椹抗氧化作用为考察指标，采用DPPH法，以羟基自由基半数清除率IC50测定指标，在单因素考察的基础上采用正交设计法，以乙醇浓度、溶剂用量、提取时间为考察因素，优化建立桑椹活性成分群提取工艺，确定桑椹自由基清除能力最佳的活性成分群提取工艺为50%乙醇20 mL超声提取30 min，经验证该工艺稳定可行，试验结果明确了50%乙醇提取物是桑椹发挥抗氧化作用的最佳活性部位。对不同产地、不同流通地、采摘与市售桑椹的抗氧化活性进行评价，各批次桑椹羟基自由基半数清除率IC50在0.041～0.456，抗氧化作用良好。广西来宾市采摘味甜的桑椹抗氧化性最强，但综合全部采摘与购买的桑椹样品抗氧化作用无明显差异，酸、甜不同的口感与抗氧化作用间没有直接的相关性。

本文采用DPPH法基于自由基清除能力考察建立了桑椹活性成分群提取的最佳工艺，并对不同批次桑椹样品抗氧化效应进行测定，为后期相关产品的研发奠定基础。