谢挺，赵晖

（1.河池学院，广西河池547000；2.广西大学，广西南宁530004）

菜豆，别称芸豆，俗称二季豆或四季豆，属于蔷薇科目菜豆属的植物。菜豆目前在全世界进行大面积的种植，菜豆作为最有营养价值的蔬菜种类之一[1]。菜豆主要包括食用纤维、矿物质营养元素、维生素与植物营养素的重要来源[2]。每千克的菜豆含有叶绿素约为91.93 mg、VC约为 133 mg、有机酸约为 172 mg、蛋白质含量很高达到4.27%、总糖含量为3.12%，所以具有很高的食用价值[3]。长期食用菜豆可以起到提高免疫力、提升血管弹性、增强机体的抗氧化能力、增强心脏功能、平衡血糖等作用。另外，菜豆中还含有黄酮类化合物具有增强免疫、抗病毒、抗氧化能力等作用[4]。目前对菜豆的研究很少，大部分的了解仅仅处在基本的营养成分方面，并且菜豆在食用过程中时常有中毒情况发生，使得大众对于菜豆的认识较为片面。

当前还没有利用响应面法来提取菜豆总黄酮的相关报道，为此本文采用微波辅助法来提取菜豆总黄酮，利用响应面法优化出一种提取菜豆总黄酮的最佳工艺，并且对运动大鼠进行灌胃处理，探讨菜豆总黄酮对运动大鼠心肌线粒体的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

菜豆：新农部落生鲜专营店；乙醇（分析纯）：天津科密欧试剂有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：上海纪宁实业有限公司；SPF级雄性SD大鼠50只，体重在（200±5）g：苏州西山中科实验动物有限公司（SYXK（苏）2012-0009）。

1.2 仪器与设备

Xinyi-2A型微波超声波萃取仪：宁波新艺超声设备有限公司；WK-150型粉碎机：山东精诚医药装备有限公司；J-SKY型电子天平：昆山巨天仪器设备有限公司；DFY-200C型粉碎机：上海利闻科学仪器有限公司；UV759型紫外可见分光光度计：青岛聚创环保设备有限公司；AYDHG-101A型电热鼓风干燥箱：江苏安盈环境设备有限公司；ZH-PT型实验跑台：安徽正华生物仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菜豆总黄酮的提取

将菜豆放置于55℃的烘箱中干燥150 min之后，将其粉碎，使用100目筛选取粒径为≤0.15 mm的粉末备用。称量若干菜豆粉末，并且将其放入三角瓶中，加入一定量的乙醇浸泡60 min。将其放入到微波超声萃取仪中，按照预先设定的时间、温度、功率进行提取，待提取完成之后，趁热进行过滤，将滤液转入50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容。按照芦丁标准曲线的方法测定其吸光度，并且将得到的吸光度值代入到芦丁标准曲线方程中，从而计算菜豆中总黄酮的浓度，并用总黄酮的提取率公式计算提取率[5]。

式中：Y为菜豆总黄酮提取率，%；C为提取液的浓度，mg/mL；V为样品溶液的体积，mL；N为稀释的倍数；M为菜豆粉末的质量，g。

1.3.2 标准曲线的绘制

准确称取在120℃下干燥至恒重的芦丁标准品30.12 mg，并且将其放入到100 mL烧杯中加入50%乙醇溶液溶解，并且转移到50 mL容量瓶中，摇匀，将其配置成浓度为0.6 mg/mL的芦丁标准溶液。并精密量取配置完成的芦丁标准液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，转移到10 mL容量瓶中，分别加入5%硝酸钠溶液0.3 mL，静置7 min。加10%硝酸铝溶液0.3 mL，静置7 min。加入1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，最后用50%乙醇溶液定容至刻度，静置20 min后，分别在510 nm处测定其吸光度。以芦丁标准品的浓度为横坐标（x），以吸光度为纵坐标（y），得到线性回归方程为y=2.343x-0.009（R2=0.999 2），表明线性关系良好，可信度较高[6]。

1.3.3 菜豆总黄酮提取单因素试验

1.3.3.1 液料比对菜豆总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数为60%、微波时间16 min、微波功率为300 W、提取温度为50℃的条件下，设定不同液料比为 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g），测定提取液的吸光度，计算菜豆总黄酮提取率。

1.3.3.2 乙醇体积分数对菜豆总黄酮提取率的影响

在液料比为 20 ∶1（mL/g）、微波时间 16 min、微波功率为300 W、提取温度为50℃的条件下，设定不同乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%，测定提取液的吸光度，计算菜豆总黄酮提取率。

1.3.3.3 微波时间对菜豆总黄酮提取率的影响

在液料比为20∶1（mL/g）、乙醇体积分数为60%、微波功率为300 W、提取温度为50℃的条件下，设定不同微波时间为 8、12、16、20、24 min，测定提取液的吸光度，计算菜豆总黄酮提取率。

1.3.3.4 微波功率对菜豆总黄酮提取率的影响

在液料比为20∶1（mL/g）、乙醇体积分数为60%、微波时间16 min、提取温度为50℃的条件下，设定不同微波功率为 200、250、300、350、400 W，测定提取液的吸光度，计算菜豆总黄酮提取率。

1.3.3.5 提取温度对菜豆总黄酮提取率的影响

在液料比为20∶1（mL/g）、乙醇体积分数为60%、微波时间16 min、微波功率为300 W的条件下，设定不同提取温度为 40、45、50、55、60 ℃，测定提取液的吸光度，计算菜豆总黄酮提取率。

1.3.4 动物分组与运动方案

选取SPF级雄性SD大鼠50只，体重在（200±5）g，随机分成5组，每个小组10只大鼠，分成对照组、运动组、低、中、高剂量菜豆总黄酮组。其中对照组不进行任何运动，其它4组进行跑步训练，时间持续4周。低、中、高剂量菜豆总黄酮组每天按剂量分别灌胃菜豆总黄酮80、160、240 mg/kg，运动组灌胃生理盐水 160 mg/kg。

运动方案：将大鼠放置在跑台上进行训练，每组大鼠进行5°，20 m/min，直至大鼠力竭。判断力竭状态的标准，使用毛刷刺激大鼠尾部，如果大鼠跑动速度与预设速度出现差距，并且其臀部压在跑台上，大鼠的后肢跟随转动跑台的皮带后拖达到20 s，则视为大鼠处在力竭状态[7]。大鼠在4周实验结束之后，采集大鼠血液，并对相关指标 SOD、GSH-Px、MDA、CAT 含量根据酶学试剂盒的说明书检测分析。

1.4 统计学分析

本文使用SPSS 18.0软件进行数据分析，数据均使用均值±标准差来表示，采取组间进行对比，P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对菜豆总黄酮提取率的影响

液料比对菜豆总黄酮提取率的影响见图1。

图1 液料比对菜豆总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根据图1分析得出，随着液料比的增加，菜豆总黄酮提取率逐渐提高，当液料比达到25∶1（mL/g）时，提取率达到最高。继续增加液料比，提取率反而稍有下降的趋势。可能因为液料比的增加，使得溶剂与提取物接触的更加充分，但是液料比过大时，体系中可能出现其他可溶性的杂质与黄酮竞争溶剂，从后续处理的便捷性以及节约成本来考量，选择液料比为25∶1（mL/g）更为合适[8]。

2.1.2 乙醇体积分数对菜豆总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对菜豆总黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对菜豆总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根据图2分析得出，在乙醇体积分数40%～60%之间，菜豆总黄酮提取率是逐渐上升的，当乙醇体积分数在60%时，提取率达到最高。但是在60%～80%之间，菜豆总黄酮提取率反而降低。首先随着乙醇体积分数的增加，有利于样品的提取，但是溶剂一旦超过一定的浓度就会导致样品中其他亲脂性成分溶出，影响菜豆总黄酮的溶解度[9]。

2.1.3 微波时间对菜豆总黄酮提取率的影响

微波时间对菜豆总黄酮提取率的影响见图3。

图3 微波时间对菜豆总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of microwave time on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根据图3分析得出，随着时间的延长，菜豆总黄酮提取率逐渐提高，当微波时间达到16 min时，提取率达到最高，之后继续延长时间，提取率变化不大。可能是因为微波时间短时菜豆总黄酮溶出不完全。但是微波时间过长会导致菜豆总黄酮结构遭到破坏，造成不必要的浪费[10]。

2.1.4 微波功率对菜豆总黄酮提取率的影响

微波功率对菜豆总黄酮提取率的影响见图4。

图4 微波功率对菜豆总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根据图4分析得出，随着微波功率的增加，菜豆总黄酮提取率逐渐升高，当微波功率为350 W时，菜豆总黄酮提取率达到最大。继续升高微波功率，菜豆总黄酮提取率开始降低。这是因为微波功率较低时，菜豆细胞的破壁程度较低，导致菜豆总黄酮溶出量较少，随着微波功率的逐渐增加，破壁能力增加，溶出效果增加，但是微波功率继续增加，会使溶剂的挥发速度增加，同时也增加了总黄酮的降解速度，导致菜豆总黄酮提取率下降[11]。

2.1.5 提取温度对菜豆总黄酮提取率的影响

提取温度对菜豆总黄酮提取率的影响见图5。

图5 提取温度对菜豆总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from kidney bean

根据图5分析得出，菜豆总黄酮提取率表现为先升高后降低的状态，菜豆总黄酮提取率在50℃时达到最高。可能是因为温度的提升使得菜豆中的总黄酮溶解度升高，使得提取率上升，一旦温度继续上升，菜豆中其他的亲脂性物质就会溶出，影响总黄酮的提取率。

2.2 响应面法试验工艺设计表及结果分析

2.2.1 响应面法试验工艺设计表

在单因素试验的基础上，通过菜豆总黄酮提取率（Y）为指标，选取乙醇体积分数（X1）、微波功率（X2）和微波温度（X3）3个对菜豆总黄酮提取影响较大的因素，进行三因素三水平响应面试验设计，采用Design-Expert 8.0软件设计的Box-Behnken试验，试验因素与水平见表1。

2.2.2 试验结果与分析

在单因素试验的基础上，确定各因素最佳水平值范围，响应面分析方案与结果见表2。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平Table 1 Box-Behnken test design factor level

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken test design and results

利用Design-Expert 8.0软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到多元回归方程：

Y=2.43 ＋0.048X1-0.040X2＋0.033X3-0.013X1X2＋0.038X1X3-0.082X2X3-0.36X12-0.15X22-0.16X32

回归方程的方差分析结果见表3。

表3 响应面回归模型ANOVA分析结果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

续表3 响应面回归模型ANOVA分析结果Continue table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

由表3的ANVOA分析可知：模型P=0.000 1＜0.01（极显著），失拟项 P=0.889 9＞0.05（不显著），说明方程对试验具有较好的拟合性，试验误差较小。相关系数R2=0.992 8，调整系数Adj.R2=0.983 5也表明模型拟合程度较好。说明该模型适合菜豆总黄酮的提取。

通过表3分析可知，对菜豆总黄酮提取率影响次序为：乙醇体积分数（X1）＞ 微波功率（X2）＞ 微波温度（X3）。并且乙醇体积分数（X1）、微波功率（X2）影响都达到了极显著水平（P＜0.01），微波温度（X3）达到了显著水平；X1X3达到显著水平（P＜0.05）、X2X3达到极显著水平（P＜0.01）；乙醇体积分数（X1）、微波功率（X2）和微波温度（X3）各因素的二次项对菜豆总黄酮提取率影响极显著（P＜0.01）。

2.2.3 响应面分析最佳工艺方案

图6表示乙醇体积分数与微波温度对提取率的影响。

图6 乙醇体积分数与微波温度对提取率的响应面分析Fig.6 Response surface analysis of ethanol volume fraction and microwave temperature on extraction rate

分析可得，乙醇体积分数与微波温度对提取率的影响是明显的。由于3D曲面陡峭，同时两者之间交互作用明显，等高线接近椭圆形。图7表示微波功率与微波温度对提取率的影响。

图7 微波功率与微波温度对提取率的响应面分析Fig.7 Response surface analysis of microwave power and microwave temperature on extraction rate

分析可得，微波功率与微波温度对提取率的影响是显著的。由于3D曲面陡峭，同时两者之间交互作用显著，等高线呈椭圆形。

通过上述分析得菜豆总黄酮提取率最佳工艺条件为：乙醇体积分数（X1）为 60.69%、微波功率（X2）为355.26 W、微波温度（X3）为50.42℃时菜豆总黄酮提取率为2.44%。考虑到实际情况方便操作稍作调整，采用乙醇体积分数为61%、微波功率为355 W、微波温度为50℃时，进行3次平行试验，以验证工艺的稳定性，实际得出的菜豆总黄酮平均提取率为2.43%，与理论值相比误差较小，表明该方案适合用来提取菜豆总黄酮。

2.3 菜豆总黄酮对运动大鼠心肌线粒体的影响

菜豆总黄酮对运动大鼠心肌线粒体的影响见表4。

表4 菜豆总黄酮对运动大鼠心肌线粒体的影响Table 4 Effects of total flavonoids of kidney bean on myocardial mitochondria in exercise rats

由表4得出，运动组与对照组相比SOD活性明显降低（P＜0.05），高剂量组的SOD活性与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05），高剂量组的SOD活性与运动组相比明显增加（P＜0.05）；运动组与对照组相比CAT活性明显降低（P＜0.05），高剂量组的CAT活性与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05），高剂量组CAT活性与运动组相比明显增加（P＜0.05）；运动组与对照组相比GSH-Px活性明显降低（P＜0.05），高剂量组的GSH-Px活性与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05），高剂量组GSH-Px活性与运动组相比明显增加（P＜0.05）。长期的力竭运动可以使心肌线粒体内的抗氧化酶 （SOD、GSH-Px、CAT） 活性降低，SOD、GSH-Px、CAT具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质[12]。菜豆总黄酮具有抗氧化能力，可以提高SOD、GSH-Px、CAT 3种酶的活性，抑制力竭运动造成的心机线粒体的损伤。

运动组与对照组相比MDA含量明显提高（P＜0.05），其中高剂量组的MDA含量与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05），高剂量组的MDA含量与力竭运动组相比明显降低（P＜0.05）。MDA是不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，其具有细胞毒性，对机体细胞有严重损伤作用[13]。菜豆总黄酮可以刺激抗氧化酶的活性，降低MDA对机体细胞损伤的影响。

3 结论

采取响应面法提取菜豆总黄酮优化出的工艺条件为：乙醇体积分数为60.69%、微波功率为355.26 W、微波温度为50.42℃时菜豆总黄酮提取率为2.44%。考虑到实际情况方便操作稍作调整，采用乙醇体积分数为61%、微波功率为355 W、微波温度为50℃时，进行3次平行试验，以验证工艺的稳定性，实际得出的菜豆总黄酮平均提取率为2.43%，与理论值相比误差较小，表明该方案适合用来提取菜豆总黄酮。同时，通过对大鼠灌胃菜豆总黄酮研究其对大鼠心肌线粒体的影响，表明菜豆总黄酮具有良好的抗氧化能力，起到清除自由基的作用，进而对心肌线粒体起到保护作用。