冯红霞，朱立红，韩跃军，马立志，费鹏，李建军，常云鹤，*

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳550005；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023）

扣碗酪是我国传统的宫廷发酵乳制品，主要利用米酒进行发酵，不需要排乳清，因此，产品不但兼有乳香和酒香，二者融合，风味独特，而且更好的保留了乳中的营养物质[1]。扣碗酪含有丰富的蛋白质、维生素和多种矿物质，且在发酵过程中大分子的营养物质被分解为小分子，更利于人体消化吸收，深受消费者的喜爱[2-3]。然而，现有关于扣碗酪的研究多集中在其发酵工艺中，这使得扣碗酪产品相对单一，不能满足消费者对扣碗酪产品多样化的需要，此外，由于采用单一的米酒发酵，导致扣碗酪产品的发酵时间较长，不利于产品的工业化发展[2，4]。

迷迭香（Rosmarinus officinalis），属于双子叶植物，唇形科，迷迭香灌木，迷迭香作为香料，具有清甜带松木香的气息风味，香味浓烈，可广泛应用于日常食品、功能食品、香料及调味品及化工等行业，被国际公认为第三代绿色食品添加剂[5-6]。此外，迷迭香提取物具有高效、无毒的抗氧化作用及多种生理功能，包括增强记忆力、镇静、安神醒脑，促进人心脑血管的血液循环，抑菌、治疗消化不良和胃痛、调理皮肤油腻、刺激头皮的毛发重新生长等[6-8]。双歧杆菌（Bifidobacterium），是常见的发酵剂，且为人和动物肠道菌群主要的成员之一，具有抗肿瘤、润肠通便、提高机体免疫力、延缓衰老、调节胃肠道平衡等多种生理功能，已经广泛的应用在了发酵乳制品的研发中[9-14]。基于以上研究背景，可以考虑研制一款以双歧杆菌为发酵剂，具有迷迭香风味的扣碗酪产品，从而解决扣碗酪产品单一，发酵时间过长的缺点。

本研究以迷迭香和全脂乳粉为主要的原料，采用双歧杆菌进行发酵，以感官评分为评价指标，分析迷迭香和水的料液比、双歧杆菌干粉添加量、米酒添加量和白砂糖加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪（Rosmarinus officinalis Kouwan Lao fermented by Bifidobacterium，ROKLB）感官品质的影响，并利用正交试验确定该产品的最佳配方。在此基础上，利用Fenton反应法、邻苯三酚自氧化法和DPPH比色法揭示迷迭香双歧杆菌扣碗酪对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除效果，从而评价其抗氧化能力，为开发扣碗酪新产品提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料

迷迭香（Rosmarinus officinalis）：河南省洛阳市；双歧杆菌（Bifidobacterium）：东北农业大学乳品科学教育部重点实验室馈赠。

白砂糖、全脂乳粉、江米、安琪酒曲：洛阳大张超市；无水乙醇：苏州科伦化工有限公司；邻苯三酚：山东佰仟化工有限公司；硫酸亚铁、邻二氮菲：济宁宏明化学试剂有限公司；DPPH、过氧化氢、氢氧化钠：雄县莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GL124-1SCN电子天平：北京奥数仪器有限公司；LDZH-100KBS立式自动电热蒸汽灭菌器：青岛化工仪器设备有限公司；GZX-DH-300-BS-II 43L小容量电热恒温干燥-培养两用箱：四川奥美仪器设备有限公司；BIOBASE超净工作台：深圳市蓝思净化科技有限公司；JHH6A精密数显恒温水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司；UPG-752分光-紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香双歧杆菌扣碗酪的制备

根据蔡晓琳[15]的方法制备迷迭香双歧杆菌扣碗酪，主要工艺流程如下：江米200 g→洗净，浸泡2 h→锅蒸30 min→冷却到30℃左右→加入安琪酒曲（10%）→30℃培养3 d→滤液→得到米酒滤液（酒精度12%）；米酒滤液、迷迭香浸提液、白糖和双歧杆菌加入到全脂乳粉中→42℃恒温培养2.5 h左右→4℃后熟12 h。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 料液比对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

按照全脂奶粉为18%计算，依次以迷迭香∶水为0.5 ∶100、1 ∶100、1.5 ∶100、2 ∶100、2.5 ∶100（g/mL）按照工艺流程制备样品，根据感官评定的结果分析迷迭香∶水对迷迭香双歧杆菌扣碗酪品质的影响。

1.3.2.2 双歧杆菌干粉添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

按照全脂奶粉为18%计算，选取0.125%、0.2505%、0.375%、0.500%、0.625%的双歧杆菌干粉添加量制备扣碗酪样品，分析双歧杆菌添加量对产品感官评定的影响。

1.3.2.3 米酒添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

按照全脂奶粉为18%计算，选取14%、16%、18%、20%、22%的米酒滤液（体积比）比例制备样品，分析米酒添加量对产品感官评定的影响。

1.3.2.4 白砂糖添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

按照全脂奶粉为18%计算，选定1%、2%、3%、4%、5%的白砂糖添加量制备扣碗酪样品，分析白砂糖添加量对产品感官评定的影响。

1.3.3 正交试验

在单因素试验基础上，选取迷迭香水提液浓度、双歧杆菌干粉添加量、米酒滤液添加量、白砂糖添加量4个因素进行产品配方的优化，因素水平表如表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.3.4 感官评定

对迷迭香双歧杆菌的感官评定是从色泽、风味、组织状态和口感这4个方面来进行分析，这4个方面占的分数分别为：15、25、25、35分，总分为 100分，感官评分表如2所示。

表2 迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评价表Table 2 Sensory evaluation form of ROKLB

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 样品预处理

以未添加迷迭香和双歧杆菌的传统扣碗酪（A组）、只添加迷迭香（B组）、只添加双歧杆菌（C组）的扣碗酪产品作为对照，分别取10 g最优配方样品（D组）和对照样品，按照无水乙醇∶产品=1∶9体积比对产品进行稀释，并将样液混合均匀，放入离心机，转速设置为4 000 r/min，时间为10 min。离心完成后，取上清液进行抗氧化活性试验。

1.3.5.2 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对·OH清除能力的测定

采用Fenton反应法[16]测定产品上清液对羟基自由基的清除率。具体操作为：取系列干净试管分别加入5 mmol/L的水杨酸-乙醇（95%）2 mL、10 mmol/L的FeSO41 mL，混匀，然后再向这些试管中分别添加空白待测液1 mL、样品待测液1 mL、去离子水1 mL，再依次加10 mmol/L的H2O22 mL、10 mmol/L的 H2O22 mL和去离子水2 mL，最后使体积至25 mL，配置好溶液后，在水浴锅设置37℃，然后计时30 min，在510 nm波长下测量吸光度值样品反复测定3次，结果取平均[16]。依据下式计算·OH的清除率：

·OH 清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0为510 nm下无待测液的吸光度值；A1为510 nm下加待测液测得的吸光度值；A2为510 nm下加待测液不加H2O2测得的吸光度值。

1.3.5.3 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对O2-自由基清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法[17]测定迷迭香上清待测液对O2-的清除率。具体操作为：配pH 8.2的50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，3 mmol/L的邻苯三酚（置于25℃的水浴锅中）及样品待测液和空白待测液备用。取4.5 mL的Tris-HCl缓冲液和4.2 mL的去离子水，混匀后放入恒温水浴锅中，在25℃的条件下保存20 min，再迅速加入0.3 mL预热过的邻苯三酸溶液，快速摇匀，在波长为325 nm处测定吸光度值，每30 s测一次，总共测10次。空白采用10 mmol/L的HCl溶液替代邻苯三酚溶液。依据以下公式计算O2-自由基清除率：

O2-自由基清除率/%＝[1-（Vx/V0）]×100

式中：V0为325 nm下未加待测液吸光度值变化率；Vx为325 nm下加待测液吸光度值变化率。

1.3.5.4 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对DPPH自由基清除能力的测定

采用DPPH比色法[18]进行测定。具体操作为：取样品待测液、空白待测液、0.2 mmol/L的DPPH－乙醇溶液。在测试管中依次加入体积均为2 mL的待测液和DPPH－乙醇溶液，在对照管中加入体积均为2 mL的待测液和无水乙醇，在空白管中加入体积均为2 mL的DPPH－乙醇溶液和无水乙醇。将以上混合溶液分别摇匀，在室温下避光静置30 min，在517 nm处测吸光度值，按照顺序记为A1、A2、A0。样品反复测 3次，结果取平均值。依据下式计算对DPPH自由基的清除率：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1为517 nm下待测液和DPPH乙醇溶液的吸光度值；A2为517 nm下待测液和无水乙醇的吸光度值；A0为517 nm下无水乙醇和DPPH乙醇溶液的吸光度值。

1.3.6 数据分析

试验中的数据以平均数±标准偏差的形式表示，利用SPSS20.0软件中的Tukey’s检验对数据进行差异分析，当P＜0.05时视为差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

选取迷迭香浸提液∶水料液比为0.5∶100、1∶100、1.5 ∶100、2 ∶100、2.5 ∶100（g/mL），分析迷迭香浸取液浓度对产品感官品质的影响，结果如图1所示。

图1 料液比对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on sensory evaluation of ROKLB

由图1中可知，迷迭香与水料液比为1∶100（g/mL）时评分最高，此时产品色泽均匀，风味适中，当迷迭香与水料液比为0.5∶100（g/mL）时产品色泽淡黄，迷迭香香味风味不足，当迷迭香与水料液比为2.5∶100（g/mL）时迷迭香香味过重，影响产品整体风味。可见，迷迭香∶水的最佳料液比为1∶100（g/mL）。

2.1.2 双歧杆菌干粉添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

选取双歧杆菌干粉添加量为0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%，分析双歧杆菌干粉添加量对产品感官品质的影响，结果如下图2所示。

图2 双歧杆菌干粉添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响Fig.2 Effect of additive amount of Bifidobacterium powderon sensory evaluation of ROKLB

双歧杆菌干粉添加量为0.375%时产品感官评分最高，添加量小于0.375%不利于扣碗酪的凝乳，产品有乳清析出的现象，大于0.375%产品的硬度较大，口感不细腻。可见双歧杆菌干粉的最佳添加量为0.375%。

2.1.3 米酒添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

选取米酒（酒精度12%vol）添加量为14%、16%、18%、20%、22%，分析米酒添加量对产品感官品质的影响，结果图3所示。

图3 米酒添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响Fig.3 Effect ofrice wineadditive amount on sensory evaluation of ROKLB

由图3可知，米酒添加量为18%时扣碗酪感官评分最高为88分，当米酒添加量大于20%或者低于16%时产品感官评分在60分左右，此时乳清洗出严重。可见米酒的最佳添加量为18%。

2.1.4 白砂糖添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响

选取白砂糖添加量为1%、2%、3%、4%、5%，分析白砂糖添加量对产品感官品质的影响，结果如图4所示。

图4 白砂糖添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评定的影响Fig.4 Effect of sugar additive amount on sensory evaluation of ROKLB

当白砂糖添加量在2%时，感官评分最高为87分，说明白砂糖最佳的添加量为2%。

2.2 正交试验

为了得到迷迭香双歧杆菌扣碗酪的最佳组合，在单因素试验的基础上进行正交试验，并进行方法分析，结果如表3所示。

表3 正交试验结果表Table 3 The orthogonal test results

由表3可知，影响迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官品质的主次顺序为：双歧杆菌干粉添加量（B）＞迷迭香∶水（料液比）（A）＞米酒添加量（C）＞白砂糖添加量（D），产品的最优组合为A2B1C3D2即迷迭香∶水为1∶100，双歧杆菌干粉添加量0.250%，米酒添加量19%，白砂糖添加量2%。按照最优组合制备迷迭香双歧杆菌扣碗酪。进行3次平行试验，产品的感官评定得分分别为92、92、93，平均得分为92.33，高于正交试验各组得分。方差分析见表4。

表4 正交试验方差分析表Table 4 Anova table of orthogonal test

由表4可知，在4个因素中，迷迭香∶水（A）、双歧杆菌干粉添加量（B）和米酒添加量（C）对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官品质有显著性影响（P＜0.05）。而白砂糖添加量（D）对产品的感官评定影响为不显著（P＞0.05）。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对·OH的清除作用

以未添加迷迭香和双歧杆菌、只添加迷迭香、只添加双歧杆菌的扣碗酪产品作为对照，分析最优迷迭香双歧杆菌扣碗酪对·OH的清除率，结果如图5所示。

图5 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对·OH的清除能力Fig.5 Ability of ROKLB to clear the·OH

由图5可知，添加了迷迭香和双歧杆菌扣碗酪（D组）对·OH的清除能力为69.85%，显著高于其它3组对照样品（P＜0.05）。此外只添加迷迭香（B组）和只添加双歧杆菌（C组）的扣碗酪样品对·OH的清除能力也有所提高，但与空白组相比并不显著（P＞0.05）。可见迷迭香双歧杆菌扣碗酪对·OH清除能力的显著提高是迷迭香和双歧杆菌协同作用的结果。

2.3.2 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对O2-自由基的清除作用

取4组扣碗酪样品（10 g），对其清除O2-自由基的能力进行测定，结果如图6所示。

图6 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对O2-自由基的清除能力Fig.6 Ability of ROKLB to clear the O2-radical

迷迭香双歧杆菌扣碗酪（D组）对O2-自由基的清除率为42.31%，显著高于其他3组扣碗酪样品（P＜0.05）。此外，单独添加迷迭香和双歧杆菌均可以显著提高扣碗酪对O2-自由基的清除能力（P＜0.05），但只添加迷迭香（B组）和只添加双歧杆菌（C组）之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3.3 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对DPPH·的清除作用

以A组、B组和C组做对照组，分析迷迭香和双歧杆菌的扣碗酪DPPH·清除能力的影响，结果如图7所示。

图7 迷迭香双歧杆菌扣碗酪对DPPH·的清除能力Fig.7 Ability of ROKLB to clear the DPPH·

迷迭香双歧杆菌扣碗酪（D组）对DPPH·的清除率为50.16%，显著高于其他3组扣碗酪样品（P＜0.05），说明迷迭香和双歧杆菌的加入提高了扣碗酪对DPPH·的清除率。

3 结论

本研究利用单因素试验和正交试验优化了迷迭香双歧杆菌扣碗酪的最优配方，即迷迭香∶水料液比为1∶100，双歧杆菌干粉添加量0.250%，米酒添加量19%，白砂糖添加量2%。其中，迷迭香∶水料液比、双歧杆菌干粉和米酒添加量对迷迭香双歧杆菌扣碗酪感官评分有显著性影响，而白砂糖添加量（D）对产品的感官评定影响不显著。迷迭香双歧杆菌扣碗酪抗氧化实验结果表明迷迭香和双歧杆菌的加入显著提高了产品对·OH、O2-·和DPPH的清除能力。迷迭香双歧杆菌扣碗酪中添加了食用型香料迷迭香和对人体有益生作用的双歧杆菌，不仅丰富了扣碗酪产品的种类，而且双歧杆菌的添加可以促进扣碗酪的凝乳，改善产品的质构特性，有利于扣碗酪产品的工业生产。此外，迷迭香和双歧杆菌的添加提高了扣碗酪的抗氧化活性，而抗氧化活性是多种益生功能的基础，因此本研究为功能性扣碗酪产品的研发提供了新的思路和理论依据。