周炳江，李靖，马长乐，*，张金丽

（1.西南林业大学园林园艺学院，云南昆明650224；2.云南省高校园林植物与观赏园艺重点实验室，云南昆明650224；3.西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224）

云南榧树（Torreya yunnanensis）为我国云南省特有植物，属于第三纪孑遗植物，且已列为国家二级濒危保护植物，现主要分布在云南省的维西、丽江、贡山、中甸等高山地带[1-3]。云南榧子具有食药价值，民间常用其种子作中药材使用，具有杀虫、消积、润肠、通便的功效[4]。

目前，国内外对云南榧子营养研究较少，马长乐等[5]对云南榧子和香榧子的油脂、蛋白和矿质元素含量进行了对比研究，得出云南榧子同样富含蛋白质和矿质元素。陈振德等[6]用重量法和气相色谱法对榧属植物的油含量及其脂肪酸组成，其结果表明云南榧子含油率（50.27%）及不饱和脂肪酸（占总脂肪酸76.1%）含量较高。此外，陈正德等[7]还对不同产地云南榧子中多糖进行了含量测定分析，云南榧子多糖含量较高及多糖组成较简单。以往研究中大多对云南榧子的几类营养物质进行研究，并未全面了解其营养成分，因此利用代谢组学对其营养价值进行全面研究是至关重要的。

代谢组学是通过核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、气相色谱（gas chromatography，GC）、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）以其与质谱（mass spectrometry，MS）联用等技术手段，采用组学分析方法，研究不同样本的所有代谢物差异分析，具有耗时短，准确度高，广覆盖的特点[8-11]。其中广泛靶向代谢组学是结合了非靶向代谢组学和靶向代谢组学的优点，基于广泛靶向代谢组数据库，采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，定性、定量样本中代谢物检测方法，具有高效、高灵敏、高覆盖的特点[12-13]。因此，可利用代谢组学对食品进行代谢产物的鉴定与分析，有助于全面了解食品的营养价值[14-15]。

本研究为全面了解云南榧子营养成分，促进云南榧子营养价值的开发，以野生云南榧子作为研究对象，利用广泛靶向代谢组学分析方法与超高效液相色谱串联质谱技术，对云南榧子代谢物进行成分鉴定与分析，为云南榧树的种植推广和保护利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Shim-pack超高效液相色谱：日本岛津公司；6500 QTRAP串联质谱：美国Applied Biosystems公司；MM 400研磨仪：德国Retsch公司。甲醇、乙腈、乙醇（色谱纯）：德国Mark公司。云南榧子于2017年9采自云南省迪庆州维西县（海拔2 190 m），选取饱满无坏的种子进行晾干处理，于室温（15℃～25℃）下贮藏备用。

1.2 方法

将云南榧子于真空冷冻干燥，用研磨仪研磨（30Hz）1.5 min，直至粉末状；准确称取100 mg的粉末，溶解于1.0 mL 70%甲醇水中，在4℃冰箱过夜，期间涡旋3次，提高提取率；10 000 g离心10 min后，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤样品，于进样瓶保存，用于超高效液相色谱-串联质谱分析。

1.2.1 液相条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）；流动相：水相为超纯水（加入0.04%的乙酸），有机相为乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脱梯度：0 min水/乙腈（95∶5，体积比），11.0 min为5∶95体积比，12.0 min为5∶95体积比，12.1 min为95∶5体积比，15.0 min为95∶5体积比；流速0.4 mL/min；柱温 40 ℃；进样量 2 μL。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度500 ℃，质谱电压 5 500 V，帘气（curtain gas，CUR）25 psi，碰撞诱导电离（collision-activated dissociation，CAD）参数设置为高。在三重四级杆（triple quadrupole，QQQ）中，每个离子对是根据优化的去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）进行扫描检测。

1.3 数据处理

质控样本：质控样本（quality control samples，QC）由3组云南榧子提取物等量混合制备而成，3个重复，与分析样本采用相同的方法处理和检测。在仪器分析的过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。

定性分析：基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建数据库（MetWare数据库V3.3）及代谢物公共数据库，根据二级谱信息对代谢物定性。

半定量分析：利用三重四级杆质谱的MRM分析完成定量，采用峰面积归一法计算个代谢物成分相对百分含量。

相对含量/%=M/N×100

式中：M为代谢物的峰面积；N为总峰面积。

2 结果与分析

2.1 样本质控结果

通过超高效液相色谱-串联质谱对云南榧子代谢物进行分析，得到总离子流图见图1。总离子流的曲线峰值保留时间和峰强度基本一致。这表明质谱对同一样品的不同时间检测时，信号较为稳定。说明此方法对云南榧子测定出的代谢物数据结果可靠。

2.2 代谢物成分组成

云南榧子共检测鉴定出440种代谢物，按其特性共分为8类见图2、表1。

图1 QC样本质谱检测总离子流图的叠加图Fig.1 Overlap total ion of quality control samples

图2 云南榧子物质的相对含量与数量Fig.2 Relative content and quantity of material seed of Torreya yunnanensis

表1 云南榧子代谢物成分列表Table 1 List of metabolites in seeds of Torreya yunnanensis

续表1 云南榧子代谢物成分列表Continue table 1 List of metabolites in seeds of Torreya yunnanensis

由图2可知，其中有机酸类121种，占总含量的33.75%；氨基酸类93种，占总含量的15.95%；脂类57种，占总含量的12.95%；其他类42种，占总含量的12.85%；核苷酸类60种，占总含量的11.05%；醇类20种，占总含量的6.19%；维生素类16种，占总含量的4.36%；糖类20种，占总含量的2.87%；吲哚类11种，占总含量的0.97%。

由表1可知，占总量1%以上的代谢物分别有：有机酸类9种：甲基苹果酸（3.898 8%）、磷酸（3.642 1%）、木糖酸（2.764 4%）、甲基丙二酸（2.582 3%）、琥珀酸（2.543 5%）、没食子酸甲酯（2.253 9%）、D-半乳糖醛酸（2.185 2%）、2-吡啶甲酸（1.3464%）、3，5-二羟基-3-甲基戊酸（1.131 4%）；核苷酸类3种：鸟苷（1.788 2%）、尿嘧啶（1.755 3%）、6-甲基巯嘌呤（1.370 2%）；氨基酸类5种：L-缬氨酸（1.886 7%）、DL-正缬氨酸（1.713 6%）、L-异亮氨酸（1.241 9%）、L-亮氨酸（1.218 0%）、DL-脯氨酸（1.134 4%）；脂类2种：溶血磷脂酰胆碱20：4（2.588 2%）、溶血磷脂酰胆碱 18：0（2.143 4%）；醇类2种，2-癸醇（1.9385%）；1-癸醇（1.8718%）；糖类1种：肌醇半乳糖苷（1.1792%）；维生素类1种：吡哆素（VB6，1.349 4%）；其它物质1种：4-硝基苯酚（8.985 7%）。

2.3 营养物质成分分析

从检测结果得知（图2，表1），在云南榧子中物质相对含量与种类最多的为有机酸类，其次为氨基酸类。基础氨基酸中仅甘氨酸未被测出，占氨基酸类的39.92%，其中组成甘氨酸的抗氧化剂与还原性谷胱甘肽分别占氨基酸类的0.31%和0.10%。氨基酸类主要成分为L-缬氨酸（11.83%）、DL-正缬氨酸（10.75%）。L-缬氨酸是人体必需氨基酸之一，缺乏时会引起神经障碍、发育停止、体重下降、贫血等及其他一系列生理问题，同时L-缬氨酸也可作营养增补剂、配制复合氨基酸输液、食品添加剂等[16]。此外，F值是支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）与芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）的物质含量比值，高F值具有辅助治疗肝性脑病、保肝、护肝、治疗苯丙酮尿症、抗疲劳、防衰老等作用，正常人血液的F值在3.5%～4.0%，肝病病人的F值低于2.5%，而云南榧子的F值为5.73%，对于肝病病人有着重要的食用价值[17]。云南榧子中的氨基酸类总量高，种类全，具有较高的营养价值，必需氨基酸占氨基酸类的33.15%，使人体易于吸收利用。一般在研究营养物质时，主要研究L-型氨基酸。在本研究中采用超高效液相色谱串联质谱技术，检测出D、DL型的氨基酸与非基础氨基酸，这些氨基酸同样具有丰富的营养功能[18]。

云南榧子脂类含量丰富，主要为磷脂类和脂肪酸类。磷脂不仅有较高的营养价值，同时还具有促进人体新陈代谢、预防疾病、增强免疫力等作用[19]。检测结果显示，云南榧子中的溶血磷脂酰胆碱共鉴定出20种，可作为食品添加剂、抑菌剂和乳化剂，在医疗及免疫学方面的研究意义重大[20-21]。此外，还鉴定出14种脂肪酸，其含量占脂类的19.28%。云南榧子的脂肪酸中含12种不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸含量占脂类的19.02%，占脂肪酸的98.69%，比陈振德等[6]所报道的76.1%还要高，可能是饱和脂肪酸的山俞酸和棕榈酸未被检测出来。本研究中，不饱和脂肪酸主要种类（占总脂肪酸）有十八碳-9E，13E，15Z-三烯酸（30.02%）、石榴酸（27.45%）、顺-11-二十碳烯酸（12.69%）、α-亚麻酸（7.79%）、亚油酸（0.23%）等；其饱和脂肪酸有2种，占总脂类的0.26%，占总脂肪酸0.26%，主要种类（占总脂肪酸）有花生酸（0.30%）、木蜡酸（1.02%）。云南榧子的不饱和脂肪酸含量较高，其不饱和脂肪酸是人体必需的营养物质，在人体内起至关重要的作用，一旦缺少就会导致各种疾病的产生。它具有调节血脂、降低胆固醇、降低高血压、抗肿瘤、预防癌症等功效[22-23]，其中石榴酸具有防治高血脂症、心脑血管疾病、抗肿瘤等效果[24]。

鉴定结果显示，云南榧子鉴定出的维生素类含量最多的为B族维生素（7种，占维生素类的87.66%），其中含量最高的是维生素B6，占维生素类的30.93%。B族维生素与维生素C（占维生素类的0.73%）为水溶性维生素，水溶性维生素具有改善患者心脏功能、改善睡眠的作用，为常见营养强化剂[25-27]。在云南榧子的糖类中肌醇半乳糖苷相对含量最高，占鉴定出的糖类的41.11%，是构成保护植物免受氧化损伤成分之一[28]，并能通过棉籽合酶的作用，与蔗糖转化成低聚糖棉子糖[29]，在食品有着非常重要的作用。

鉴定结果进一步显示，除前面常见营养物质外，云南榧子中有机酸种类丰富而使其具有独特的风味。云南榧子鉴定出的有机酸中相对含量最高的香味物质为香兰素（占有机酸类2.76%），具有香荚兰香气及浓郁的奶香，用途十分广泛，被称为“食品香料之王”[30]；同时醇类物质也是云南榧子香味的重要来源之一，1-癸醇（占醇类30.24%）具甜的玫瑰脂蜡香，略有甜橙花、铃兰花气息[31]。

3 结论

本研究以野生的云南榧子为研究对象，利用广泛代谢组学技术对云南榧子进行营养价值的评价，总共鉴定出440种代谢物。其中有机酸类的相对含量与数量最高，共121种，占总含量的33.75%，其次为氨基酸类93种（15.95%）；脂类 57种（12.95%），位于第三大类，其必需氨基酸含量较高，占氨基酸类的33.15%；脂肪酸占脂类的19.27%，不饱和脂肪酸占脂肪酸的98.69%；维生素类16种，占总含量的4.36%，其水溶性维生素（B族维生素与维生素C）占维生素类的88.39%；糖类有20种，占总含量2.87%，这些营养物质种类丰富，使云南榧子拥有丰富的营养；云南榧子中香兰素与1-葵醇含量较高，分别占有机酸类与醇类的2.76%、30.24%，可能是组成云南榧子独特的风味重要因素之一。

此次试验，微量元素虽未测定，但在科研组[5]前期测定的结果来看，云南榧子富含矿质元素，为典型的高钾低钠食品。以上这些结果都表明云南榧子的营养物质丰富，云南榧子是很好的野生食用植物资源，可加工成零食干果，未来可进一步推动其自然野生资源的开发利用与保护。