邓剑锋,李广章,刘 然,齐颖钊,刘志新

(秦皇岛市第一医院 骨三科,河北 秦皇岛066000)

腰椎间盘突出症是脊柱外科最常见的病症之一，腰椎间盘退变是引起腰椎间盘突出症的病理基础，主要表现为纤维环原与髓核之间清晰界限消失，凝胶样髓核消失[1,2]。有学者研究表示，腰椎间盘退变由营养、遗传、免疫、力学等多种因素共同造成，力学因素最为直接，直接作用于人们的直立行走[3]。腰椎间盘在行走过程中容易受到损伤，导致机体炎性因子和免疫反应被激活，使细胞核收到退变信号，影响椎间盘关键组分的合成和讲解以及核内基因表达。有学者研究中表示，椎间盘退变的发展和发生中细胞细胞外基质合成，细胞外基质分解代谢失衡起着重要作用[4]。本文研究核苷酸结合寡聚化结构域样受体含热蛋白结构域3(NALP3炎性体)、骨形态发生蛋白BMP-2在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

研究对象：在我院选取2017年6-2018年6月接受治疗的80例腰椎间盘突出症患者，男性41例，女性39例，年龄21-54岁，平均年龄(36.5±13.6)岁；病程1-6，平均病程(4.3±1.5)年。腰椎间盘突出症患者椎间盘退变使用Pfirrmann分级标准进行MRI分级，Ⅱ级患者16例，具有轻度退变，轻微降低加权信号强度；Ⅲ级29例，中度退变，中度降低加权信号强度；Ⅳ级21例，严重退变，明显降低加权信号强度；Ⅴ级14例，严重退变，严重降低加权信号强度。另外选取在我院行前路减压内固定切除的脊柱骨折患者椎间盘为正常椎间盘髓组织，男性45例，女性35例，年龄22-51岁，平均年龄(35.6±11.2)岁，两组患者一般资料比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：腰椎间盘突出症患者具有临床典型症状、体征，经过X线检查患者椎间隙明显下降，MRI显示腰椎间盘突出，TW2髓核信号降低。所有患者及其家属对本文研究均知情，并签署知情同意书。

排除标准：排除类风湿关节炎疾病者及感染性疾病者；排除合并肿瘤者；排除凝血功能异常者，排除精神疾病者，排除严重心肾肺功能不完全者。

1.2 方法

1.2.1标本制作 将所有腰椎间盘突出症患者进行手术切除，取出在纤维环内的椎间盘髓核组织。另外选取在我院行前路减压内固定切除的青壮男脊柱骨折患者椎间盘为正常椎间盘髓组织。随机取出0.5 cm2大小的退变椎间盘髓核组织块，并行常规石蜡包埋，厚度为3 cm，在0-4℃的冰箱内保存。连续切片作免疫组化标记。

1.2.2免疫组化染色 将待测标本进行脱蜡、水化后，浸泡在0.01 mol/L、95℃的枸橼酸缓冲液中，并进行热修复，培育在3%的H2O2的环境下，在山羊血清中滴入10 min后进行封闭，在25-27℃的环境下孵育0.5 h，然后抽离封闭液，将一抗加入，培养在5℃的环境中过夜，第2天加入而抗，并培养在37℃的恒温箱中0.5 h，使用PBS淋液冲洗后进行DAB显示、脱水、封片处理。

1.2.3NALP3炎性体检测 使用Western Blot检测，将PBS缓冲液清洗标本3次进行分离缓冲液裂解0.5 h，对蛋白浓度进行测定。取20 μg/孔蛋白质，在电泳10 min后加入适量SDS-PAGE蛋白缓冲液，将电转膜在10%的牛奶中浸泡，封闭在常温1.5 h的摇床上；使用TBST与一抗结合之后进行稀释，并孵育、保存；第2天使用TBST液进行清洗，与二抗结合后常温孵育1 h，再清洗，加入显影剂显色，对NALP3炎性体水平进行测定。

1.2.4BMP-2标本检测 检测BMP-2水平使用酶联免疫吸附试验法，缓冲液稀释50 mM碳酸盐包BMP-2抗原，之后添加到聚苯乙烯的反应板孔中，放置24 h温度4 ℃，次日洗涤剂洗涤3次后，抛干。在各孔中加入稀释液稀释的待测标本0.1 ml，同时加入阳性和阴性的对照标本，42 ℃放置60 min，将液体移除洗涤3次后，抛干。在各孔中加入BMP-2的酶标抗体0.1 ml，43 ℃放置60 min。液体移去，洗涤3次，抛干。在各个空中加入0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸橼酸滴液混匀,再加入0.1 ml邻苯二胺，遮光处理20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，终止反应。使用酶标仪检测405，分析BMP-2水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组研究对象NALP3、BMP-2表达比较

如表1、图1、图2所示，腰椎间盘组患者NALP3、BMP-2表达与正常组NALP3、BMP相对表达水平相比，腰椎间盘组患者NALP3表达升高，BMP-2表达降低，差异具有统计学差异(P<0.05)。

表1 两组研究对象NALP3、BMP表达比较

图1 NALP3、BMP-2在退变椎间盘髓核组织中的表达免疫组化染色图(×200)

图2 NALP3、BMP-2在正常椎间盘髓核组织中的表达免疫组化染色图(×200)

2.2 NALP3、BMP-2与退变等级的关系

如表2所示，与Ⅱ级相比，Ⅲ级、Ⅳ级、Ⅴ级患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有统计学差异(P<0.05)；与Ⅲ级相比，Ⅳ级、Ⅴ级患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有统计学差异(P<0.05)；与Ⅳ级相比，Ⅴ级患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有统计学差异(P<0.05)。

表2 NALP3、BMP-2与退变等级中的关系

注：与Ⅱ级比较，aP<0.05；与Ⅲ级比较，bP<0.05；与Ⅳ级比较，cP<0.05。

2.3 NALP3、BMP-2与患者腰部负荷严重程度的关系

如表3所示，与很轻程度相比，轻、中、重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有统计学差异(P<0.05)；与轻程度相比，中、重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有统计学差异(P<0.05)；与中程度相比，重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有统计学差异(P<0.05)。

表3 NALP3、BMP-2与患者腰部负荷严重程度

注：与很轻程度比较，aP<0.05；与中程度比较，bP<0.05；与重程度比较，cP<0.05。

2.4 NALP3、BMP-2之间相关性分析

NALP3、BMP-2之间进行Pearson相关性分析，NALP3、BMP-2之间呈负相关(r=-0.269，P=0.016)。

3 讨论

腰椎间盘细胞受外界因素影响，会导致细胞内分子水平变化，从而使细胞生物学行为变化[5]。研究证明，细胞外基质成分合成减少、分解增加也是造成腰椎间盘退变的主要因素，腰椎间盘退变是引起腰椎间盘突出的主要病理基础，严重将导致腰腿痛[6]。腰椎间盘髓核细胞衰老是造成腰椎间盘退变的重要原因，是由炎性因子刺激、细胞能力代谢障碍等导致。细胞能量代谢障碍是腰椎间盘突出症患者椎间盘退变的重要机制，一方面营养物质弥散障碍是软骨终板老化所致，一方面线粒体变形、线粒体内渗透压改变、炎性因子对线粒体的干扰是由力学因素所致且对细胞的能量代谢造成影响[7]。

NALP3炎性体是一种胞内模式识别受体，在激发免疫反应及炎性反应和调节免疫反应及炎性反应中具有调控作用[8]。研究显示，一系列不同的内源性和外源性因素对NALP3炎性体刺激后，可以将依赖在半胱氨酸激酶的活性激活[9]。炎性半胱天冬酶-1在钾内流、活性氧及溶酶体等因素的作用下被激活，从而使NALP3炎性体发生募集组装，以促进血管内皮细胞与白细胞黏附、渗透，使机体局部炎症发生[10]。研究中显示，NALP3炎性体在治疗的靶点具有一定应用价值，腰椎间盘突出症患者退变腰椎间盘髓核衰老以后NALP3炎性体表达越高，腰椎间盘突出症患者疼痛感症状越重[11,12]。

骨形态发生蛋白作为多功能生长因子，是转化生长-β超家族的一员，属于在骨和骨髓中提取的特殊蛋白质，具有一定的诱导作用[13,14]。在腰椎间盘退变的发生和发展中细胞外基质合成和分解代谢失衡具有重要作用[15,16]。骨形态发生蛋白还是一种多效的形态发生素，可以促进细胞外基质的合成[17]。研究显示，腰椎间盘细胞外基质合成代谢的重要因子之一BMP-2，可以促进体外培养腰椎间盘细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成以及表达[18,19]。同时，BMP-2在腰椎间盘退变中有一定的调节作用，参与腰椎间盘退变整个过程的调节[20]。

本文研究结果显示，在两组研究对象中，退变腰椎间盘髓核组织中NALP3炎性体表达量明显升高，BMP-2表达明显下降；腰椎间盘突出患者Ⅱ级退变腰椎间盘髓核组织中NALP3炎性体表达量低于Ⅲ级、Ⅳ级、Ⅴ级患者，BMP-2表达量高于Ⅲ级、Ⅳ级、Ⅴ级患者；腰椎间盘突出患者腰部负荷重程度退变腰椎间盘髓核组织中NALP3炎性体表达量高于很轻、中程度患者，BMP-2表达量低于很轻、中程度患者。说明腰椎间盘突出患者退变腰椎间盘髓核组织中NALP3炎性体、BMP-2存在重要的参与作用。

综上所述，NALP3炎性体在腰椎间盘突出患者退变腰椎间盘髓核组织中高表达，BMP-2在腰椎间盘突出患者退变腰椎间盘髓核组织中低表达，其表达水平与患者退变腰椎间盘髓核组织中退变等级、腰部负荷程度相关，NALP3炎性体、BMP-2在退变腰椎间盘髓核组织中起到重要的参与作用。