李凯迪，王 海，郑 岩，何成彦，齐 新

(吉林大学白求恩第三医院 检验科，吉林 长春130033)

2018年全球约有88万人死于结直肠癌，在癌症死亡率中排名第二[1]。因此，本实验目的在于分析MYH10在结直肠癌组织中的表达量及临床意义，为结直肠癌的诊断探索新的标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究所纳入的标本为吉林大学白求恩第三医院2016年7月到2017年1月经手术获得的经病理学检测所证实为结直肠癌Dukes B期腺癌，在术前未接受任何治疗，且排除已发生远端转移的患者的新鲜结直肠癌组织，共计23例。癌旁标本为距离癌组织10 cm以上且位于癌组织上段的正常组织。所有患者和家属均签署知情同意书。将依据以上标准所获取的新鲜组织冲洗后，经液氮速冻后，置于-80℃的冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1样本总蛋白提取及测定 从-80℃的冰箱中，取癌组织和癌旁组织各50 mg于PBS中清洗，在液氮中充分研磨后，分别加入适量RIPA裂解缓冲液，置于冰上，室温下，使用振荡器充分混匀。加入RNA酶和DNA酶去除RNA和DNA后离心。离心机设置为12 000 rpm，4℃，离心15 min。离心后，留取上层清液即为总蛋白。蛋白质浓度测定根据Bradford法，即使用考马斯亮蓝染液进行染色，使用分光光度计在595 nm处进行测量。绘制横坐标为蛋白质浓度，纵坐标为吸光度的蛋白质浓度标准曲线。

1.2.2蛋白水解多肽混合物的制备 取冻存的总蛋白样品，置于室温下融化。用5倍体积的50 mmol/L NH4HCO3溶解稀释蛋白样品。加入一定体积的1 mol/L的DTT，最终调定浓度为20 mmol/L，56℃下避光放置反应1 h。冷却至室温后加入一定体积的1 mol/L的IAM，调定浓度至50 mmol/L，室温避光的条件下，使其充分反应30 min。在反应体系中按蛋白∶胰酶以50∶1的比例加入测序级胰酶，置于37℃水浴箱中过夜，所得产物分装后置于-80℃的冰箱中保存。

1.2.3二维色谱质谱联用技术分析 取经上述步骤制得的样品加入0.1%FA溶解样品。取50 μg用于色谱上样，蛋白样品在流经强阳离子柱和反相柱时被洗脱分离，所获得的多肽经LTQXL离子肼质谱分析后，最终得到LC/MS图谱。

1.2.4免疫印迹试验 用免疫印迹试验分别测定目的蛋白(MYH10)在结直肠癌组织和癌旁组织的表达情况，以验证二维色谱与质谱联用技术的分析结果。

1.2.5仪器和试剂 考马斯亮蓝、二硫代苏糖醇(DTT)、NH4HCO3、碘代乙酰胺(IAM)、尿素、DNA酶、RNA酶购于美国Sigma公司，十二烷基硫酸钠(SDS)、TMED、蛋白质定量试剂盒、TPCK修饰的测序级胰酶购于Bio-Rad公司，苯甲基磺酰氟(PMSF)购于美国GE公司，MYH10单克隆抗体购于美国Abcam公司。Agilent 1200高效液相色谱仪购于美国Agilent公司，LTQXL离子肼质谱仪购于美国Thermo Fisher公司。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 二维色谱与质谱联用技术分析结直肠癌组织和癌旁组织

本实验癌组织样本和癌旁组织样本中同一个蛋白的丰度通过谱图数以衡量。我们将同时满足两个样品中蛋白谱图数比值≥1及两个样本中蛋白谱图数差值≥72的蛋白定为差异表达蛋白，依照上述标准，发现本次实验所研究的MYH10蛋白为上调蛋白，MYH10质谱图结果见图1。

图1 MYH10质谱图

2.2 免疫印迹试验分析MYH10在结直肠癌和癌旁组织的表达

使用免疫印迹试验分析MYH10在结直肠癌组织和与之相对的癌旁组织的表达情况，结果显示，MYH10蛋白在结直肠癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，与二维色谱与质谱联用技术所获得的结果一致，免疫印迹试验结果见图2。

图2 MYH10在癌旁组织(A)、结直肠癌组织(B)

3 讨论

非肌肉肌球蛋白(NMM-Ⅱ)是一种六聚体分子，由2条重链、2条调节性轻链和2条必须轻链所构成的。其3种亚型分别为NMMⅡ-A、NMMⅡ-B和NMMⅡ-C分别由MYH9、MYH10和MYH14基因编码[2]。有报道表明NMM-Ⅱ作为细胞骨架的关键调节因子之一，参与了如细胞活化、囊泡转移等一系列的细胞活动[3]。

MYH10作为超家族蛋白质编码基因之一，位于17p13.1,广泛的存在于不同的细胞和组织中[4]。除了参与正常的细胞生理活动，同时与癌症的发生、发展密切相关[5]。Liu等人通过对膀胱癌的研究证实，MYH10可以作为影响膀胱癌患者预后的候选生物标志物之一[6]。Bluteau等人的研究表明，MYH10受RUNX1基因负向调控，当RUNX1基因缺失，MYH10在血小板中持续性表达，遗传性和获得性血液系统恶性肿瘤的发生可能与之相关。可以将检测MYH10基因作为血液系统恶性肿瘤的筛选标记物[7]。刘等人的研究表明，MYH10基因的表达与卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭的能力高度相关。该研究还证实MYH10基因的表达量与卵巢癌的复发、转移以及肠道转移呈正相关，可以作为卵巢癌患者的独立预后因素[8]。Guo等人的研究认为MYH10基因可以改变ECM(细胞外基质)[9]。大量的研究表明，肿瘤细胞外基质成分的变化对肿瘤的发展起着重要的调控作用[10]。Wang等人沉默人脑胶质瘤细胞中的MYH10基因后发现Wnt/β-catenin信号通路受到抑制[11]，先前的研究表明，Wnt/β-catenin通过促进上皮-间质转化(EMT),即上皮细胞向间质细胞转化，大大提升了肿瘤的抗凋亡能力，使细胞的转移和侵袭能力增强。而抑制Wnt/β-catenin信号通路可以减弱肿瘤细胞的侵袭和转移能力[12]。Surcel等人的研究表明4-羟基苯乙酮(4-HAP)通过靶向调控MYH10以及MYH14改变细胞力学，减弱了胰腺癌细胞的侵袭性和转移，为癌症治疗提供了新思路[13,14]。先前的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌的发生、发展起到了关键的作用[15]。MYH10基因是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路，增强肠癌细胞的侵袭和转移，最终影响结直肠癌患者的预后，还需要进一步的实验以验证。

本实验通过二维色谱-质谱联用技术分析了结直肠癌肿瘤组织和癌旁组织的MYH10蛋白表达情况，并通过免疫印迹的方法得以验证，结果显示MYH10蛋白在结直肠肿瘤组织中明显升高，可以作为诊断结直肠肿瘤的候选生物标志物之一。