许超，俞蕾，盛成兰，史伟峰(. 上海市第十人民医院崇明分院检验科，上海 050；. 苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州 3003)

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是引起重症手足口病的重要病毒之一，其临床表现除典型的手、足、口等部位出现疱疹以外，还会继发心肌炎、脑膜炎和肺水肿等并发症，有的甚至导致死亡[1]。2A蛋白酶是肠道病毒重要蛋白质之一，不仅参与病毒的生命周期，而且作用于多种细胞蛋白质，影响宿主细胞的生物学功能[2]。泛素特异性蛋白酶4(ubiquitin-specific protease 4，USP4)是去泛素化酶家族中重要一员，诱导底物蛋白质活化或失活，达到调节信号通路的作用，主要参与肿瘤的生成和病毒感染[3-5]。本研究旨在证实EV71在感染细胞过程中可通过2A蛋白剪切宿主蛋白USP4，抑制细胞抗病毒作用，从而逃逸免疫应答，为人类认识病毒逃逸宿主免疫应答提供一条新思路，以期为相关的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1抗体、病毒和细胞来源 兔抗人USP4抗体(美国CST公司)，鼠抗Flag抗体(美国Sigma公司)，兔抗GAPDH抗体(美国SAB公司)，鼠抗EV71/VP1抗体(英国Abcam公司)，pIRES2-EGFP-2A-Flag、pIRES2-EGFP-3C-Flag表达质粒(上海权阳生物公司)，EV71病毒株GDV083(ATCCVR784，基因编号：U22521)购自中国科学院武汉病毒所，人横纹肌肉瘤(RD)和293T细胞购自中国科学院细胞资源中心。

1.2主要试剂与仪器 DMEM培养基和10%胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)，2.5 g/L胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，细胞培养瓶、培养板、离心管、冻存管(美国Corning公司)，Trizol试剂、Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司)，5×SDS蛋白质上样缓冲液、蛋白质提取试剂盒、配蛋白质胶试剂盒、BCA蛋白质定量试剂盒(上海碧云天公司)，5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、10×电转液(北京索莱宝公司)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、ECL化学发光显影液(美国Millipore公司)，RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；CLINX化学发光成像系统(上海勤翔科技公司)，SMA1000超微量紫外分光光度计(北京普莱恒通科技公司)，7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，低温高速台式离心机(美国 Bierlofuge公司)，凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。USP4siRNA由苏州金维智公司设计合成(USP4基因ID：7375)，见表1；USP4、EV71/VP1引物根据基因序列(EV71/VP1基因ID：KU645338.1)，通过Primer Premier 5.0软件设计，由苏州金维智公司合成，见表2。

表1 USP4 siRNA序列

表2 USP4和EV71/VP1引物序列

1.3空斑试验检测病毒滴度 将RD细胞密度调整为1×105/mL，接种96孔板，每孔100 μL，培养细胞融合度至80%～90%。将病毒原液梯度稀释为10-1～10-10浓度：先向10支EP管中各加入900 μL含2% FBS的DMEM培养基，第1支EP管中加入100 μL病毒原液，混匀后(即10-1稀释度)从中吸取100 μL至第2支EP管中，以此类推，加到最后第10支EP管中(即10-10稀释度)。弃去细胞培养板中的原培养基，PBS洗2遍，按顺序将各稀释度病毒加至96孔板中，每孔100 μL，每个浓度梯度共8个复孔。对照组中加100 μL含2% FBS的培养基代替病毒液，置5% CO2、37 ℃培养1.5 h后，弃上清液，用PBS洗2遍，每孔加100 μL 2% FBS培养基，继续培养，每天观察细胞形态并记录结果，持续观察时间不超过7 d。每天用倒置显微镜观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)情况，记录RD细胞病变程度。结果判定与计算：按照Reed-Muench公式计算半数组织培养感染计量(TCID50)[距离比例=(高于50%的病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)，lg TCID50=病变率高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之间的差]。空斑形成单位(plaque forming unit, PFU)=0.7×TCID50；感染复数(multiplicity of infection, MOI)=病毒滴度×取病毒液体积/转染的细胞数，病毒滴度即PFU计算结果(单位PFU/mL)。

1.4EV71病毒感染RD细胞 取生长状态良好的RD细胞，用含10%FBS的DMEM培养基常规培养，待细胞融合度达90%时，弃培养基，PBS洗涤2次，用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，接种至6孔细胞培养板(每孔4×105个)，继续培养24 h。加入MOI=1的EV71，室温温育1 h后，更换新的DMEM培养基继续培养，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h时经2.5 g/L胰蛋白酶消化并1 000 r/min离心5 min收集细胞，提取RNA或蛋白质，用于目的基因或蛋白质的检测。

1.5实时荧光定量PCR 取1.4各组细胞，按照试剂盒说明进行细胞RNA提取、RNA逆转录以及实时荧光定量PCR。PCR总体系为20 μL，包括SYBR Green Master mix 10 μL，ROX校正染料Ⅱ0.4 μL，10 μmol/L上、下引物(根据表2，针对目的基因加入对应引物)各0.4 μL, cDNA 2 μL，RNA Free ddH2O 6.8 μL。PCR循环参数：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。在60 ℃时用7500 v2.0.6软件收集荧光信号。用2-△△Ct法计算VP1mRNA相对表达水平，△△Ct=(Ct目的基因- Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因- Ct内参基因)对照组，内参基因为GAPDH。每个样本做3个复孔，实验重复3次。

1.6western blot 取1.4各组细胞，经胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，加入蛋白质裂解液，冰上裂解40 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清液，用BCA法测定总蛋白质浓度。每孔取35 μg蛋白质加样，行10 g/L SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后，300 mA恒流1.5 h将蛋白质转移至PVDF膜，放置脱脂奶粉中室温封闭1 h，分别加相应一抗(均为1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；TBST洗膜3次，每次5 min，再加入二抗(1∶1 000稀释)，室温1 h；TBST洗膜3次，每次5 min，用ECL发光液显色，在CLINX化学发光成像仪中显影，应用凝胶图像分析系统及Image J软件对条带进行灰度扫描进及结果判读。实验重复3次。

1.7细胞转染试验USP4基因敲除：将RD细胞种于6孔板，待细胞融合度达40%时，先等体积混合siRNA与转染试剂Lipofectamine 2000，弃原培养基，加入新的培养基继续培养48 h，即完成转染。过表达质粒转染：将过表达质粒pIRES2-EGFP-2A-Flag和pIRES2-EGFP-3C-Flag(各0.5 μg、1 μg、2 μg)转染至293T细胞，先将体积混合表达质粒与转染试剂Lipofectamine 2000，弃原培养基，加入新的培养基继续培养24～48 h，每隔12 h，用荧光显微镜观察转染效率，待细胞转染率达90%左右，即完成转染。48 h时收集蛋白质，同1.6进行western blot检测。

2 结果

2.1病毒滴度的检测 病毒稀释度在10-5～10-6之间，细胞出现病变率为50%。按Reed-Muench公式计算：距离比例=(52.6%-50%)/(52.6%-30.0%)=0.11，lg TCID50=(-5)+0.11×(-1)=-5.11，含义：将该病毒原液稀释105.11倍后取100 μL接种细胞可使50%的细胞发生病变。见表3。TCID50=105.11，PFU=0.7×105.11=9.0×104，病毒原液滴度为：9.0×104÷0.1=9.0×105PFU/mL。

表3 病毒滴度测定统计结果

2.2EV71感染RD细胞后USP4的表达情况

2.2.1EV71感染RD细胞后USP4mRNA表达水平 与对照组0 h(1.03±0.04)相比，实验组在EV71感染RD细胞8、12和24 h时VP1mRNA的表达水平降低(分别为0.83±0.02、0.66±0.04和0.52±0.02)，差异均有统计学意义(t=4.50、t=6.39和t=11.56，P<0.05)；感染2 h和4 h时USP4mRNA表达量与0 h相比，差异均无统计学意义(t=0.35，t=0.89，P>0.05)。

2.2.2EV71感染RD细胞后USP4和VP1蛋白质表达水平 实验组在EV71感染RD细胞8、12和24 h后USP4蛋白的灰度比值分别为0.51±0.02、0.39±0.03和0.25±0.01，相对于对照组0 h(1.25±0.01)均下降(t=57.32、t=47.10和t=122.5，P<0.05)；实验组中感染2 h和4 h 后USP4蛋白表达量(分别为1.30±0.03和1.28±0.02)和对照组0 h比较，差异均无统计学意义(t=2.74、t=2.32，P>0.05)。VP1蛋白表达在感染8 h后出现，同时宿主蛋白USP4出现切割带，见图1。

2.3敲减USP4后USP4、VP1mRNA表达水平及病毒滴度变化

2.3.1USP4敲除后USP4mRNA表达水平 与对照组USP4mRNA表达水平(0.96±0.02)比较，USP4siRNA1、USP4siRNA2和USP4siRNA3转染后USP4mRNA表达水平分别为0.29±0.04、0.67±0.03和0.48±0.04，以USP4siRNA1敲减效果明显(t=13.65，P<0.05)。

2.3.2USP4siRNA1敲除组和对照组中VP1mRNA表达水平 对照组中8、12和24 h与0 h比较，VP1mRNA表达水平逐渐升高；USP4siRNA1转染组与对照组VP1mRNA表达水平变化趋势一致，但与对照组中同一时间点(8、12和24 h)比较，VP1mRNA表达增加，差异有统计学意义(t=17.51、t=15.59和t=5.17，P<0.05)，见表4。

表4 敲除组和对照组中VP1 mRNA相对表达水平

2.3.3空斑实验检测病毒滴度 与对照组病毒滴度[(8.20±0.17)×105PFU/mL]比较，UPS4siRNA1敲除组病毒滴度[(10.55±0.29)×105PFU/mL]升高，差异有统计学意义(t=6.98，P<0.05)。

2.4EV71中的2A蛋白酶切割细胞中USP4蛋白 western blot检测结果发现转染2A表达质粒的细胞USP4出现明显切割条带，见图2A，而转染3C表达质粒的细胞则无；当增加2A质粒的表达，USP4的切割条带也随即增多，见图2B。

3 讨论

人体本身存在抗病毒天然免疫，病毒能在宿主细胞中增殖，则需要通过各种方式逃逸机体的免疫应答。EV71基因组属于单股正链RNA，主要被维甲酸诱导基因I样受体(RIG-I like receptor，RLR)家族中黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene-5，MDA5)受体识别，激活宿主细胞的免疫应答，其中RIG-1也起到部分作用，具体作用机制尚不清楚[6]；RLR信号通路受到去泛素化酶的调节，研究发现，USP4可通过特异性去除RIG-1蛋白的K-48泛素连接，从而稳定RIG-1蛋白，发挥正向调节RLR抗病毒信号通路的作用[7]。我们在EV71感染的过程中发现USP4参与抗病毒免疫应答，通过基因的敲减，USP4表达受到抑制，更加有利于EV71的增殖和复制，同时，宿主蛋白USP4被剪切,说明USP4很有可能在EV71的感染过程中起到正性调节抗病毒信号通路的作用。

EV71含有4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和 VP4)和7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)，非结构蛋白虽然不构成病毒的颗粒，但是对病毒的入侵和复制起到重要作用。2A和3C蛋白酶是病毒的2个重要蛋白酶，研究发现，EV71中的非结构蛋白2A可直接通过剪切或降解抗病毒信号通路中关键蛋白MDA5和线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS)，导致蛋白质功能失活，从而影响细胞的抗病毒作用[8]；3C蛋白酶也具有相似作用，其可通过剪切DNA修复酶，激活凋亡通路，进而诱导细胞凋亡，促进细胞释放病毒[9]。本研究发现2A 蛋白酶具有切割USP4的功能，但3C蛋白酶并不切割USP4，因此2A蛋白酶与USP4蛋白之间的作用可能具有特异性，随着2A蛋白酶表达的增加，USP4的切割条带也在增多，更加说明USP4蛋白在EV71感染过程中被切割，可能是2A蛋白酶的直接作用。

综上所述，本研究发现2A蛋白酶可能作用于蛋白USP4，从而抑制USP4的表达，有利于病毒复制，为临床治疗手足口病提供新的实验依据。但本研究仍然存在不足之处，目前国内无法购买2A蛋白酶的试剂，再加上实验条件的限制，因此无法研究体外蛋白质结合的作用，2A蛋白酶与USP4的结合位点以及切割的片段是否促进病毒的复制，需要进一步去探索；另一方面，本研究的层次局限于细胞水平，EV71在感染小鼠过程中是否具有同样的结果，这是未来的研究工作方向之一。