摘 要：建立Taqman探针实时荧光PCR检测方法。选择牛、羊线粒体16SrRNA靶序列，设计合成引物和探针，鉴别羊乳制品中的羊乳成分。结果表明，该方法最低可检测掺入2.0%牛源性成分的羊奶制品，具有灵敏、快速、高效以及高通量等优势，可作为羊奶制品羊乳成分掺假鉴别手段之一。

关键词：羊乳制品掺假；牛乳；实时荧光PCR；Taqman探针法

羊乳制品的营养价值高，现代营养学的相关研究表明，羊乳含有200多种营养物质和生物活性因子，其蛋白质、矿物质和维生素的总含量均高于牛乳[1]。羊乳中蛋白质凝块细而软，脂肪颗粒较小，易消化吸收[2]，人体对羊乳的吸收率在94%以上，特别适合婴幼儿、老年人和身体虚弱者饮用。营养成分组成及基础结构、各营养元素配比以及营养特性都与母乳最为接近，因此在婴幼儿食品中优势明显。同时羊乳中不含过敏性蛋白，不易出现过敏等现象，被营养学家推荐为牛乳过敏人群的最佳替代乳品[3-4]。近年来，羊乳相关产品的流行已渐成趋势，市场上产品种类越来越多，在经济利益的驱动下，一些不法商贩和企业在羊乳中掺入牛乳以降低成本，牟取暴利。实时荧光PCR技术从基因水平分析物种来源，Taqman real-time PCR法具有灵敏度更高、特异性更强的特点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

鲜羊乳来自内蒙古蒙恩公司纯羊奶，牛乳来自市售伊利集团有限公司。

1.1.2 主要仪器和材料

仪器：实时荧光PCR仪（Quant StudioTM 7 Flex）购于赛默飞世尔公司，超微量紫外分光光度计（Nano drop one）购于赛默飞世尔公司。

试剂：PCR引物和探针（上海生工生物工程有限公司合成）；Wizard磁珠法食品DNA纯化系统（货号：FF 3751）由美国Promega生物技术公司生产；Probe qPCR mix（货号：RR391A）TakaRa（中国）宝日生物公司；Real-time PCR Bovine DNA Detection Kit（货号：RR910）TakaRa（中国）宝日生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脱脂样品的制备

新鲜奶粉中脂肪含量较高，需要先去除脂肪纯化样品[6]。样品冷藏1～2 h，2 000 g离心5 min，去除上层脂肪。若为脱脂样品则直接用于DNA提取。

1.2.2 DNA的提取

乳制品中DNA含量低，因此称取脱脂后样品1 g放入50 mL离心管中，之后按照提取试剂盒说明书中的步骤进行操作，最后用50 μL无核酸酶水洗脱，洗脱步骤可分多次洗脱，以提高回收率。提取后的样品经超微量紫外分光光度计测定，DNA浓度为752 ng/mL和810 ng/mL，于4 ℃保存。

1.2.3 引物设计

采用Prmimer Premier 5.0引物设计软件，经Blast比对后选取特异性引物和探针。牛源性引物及探针均采用TakaRa公司试剂盒。引物探针序列见表1。

1.2.4 Taqman实时荧光定量PCR反应

25μL PCR反应体系：12.5 μL qPCR mix（2×），0.5 μL上下游引物，1μL探针，2 μL模板，8.5 mL ddH20。

PCR上机程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。

2 结果与分析

2.1 乳DNA中羊源性成分、牛源性成分特异性检测

选取线粒体基因组参照文献[5]设计羊源性特异性引物因为脊椎动物线粒体基因在物种间特异性强。

实验结果表明，在羊源性引物中加入羊源性引物探针，牛源性引物中加入牛源性引物探针观察到明显扩增曲线，如图1。

在交叉模板中未出现扩增曲线，结果见图2。证明所设计的引物和探针具有较为明显的特异性。通过实验证明，根据牛、羊引物探针的特异性所建立的基于Taqman探针法实时荧光定量PCR可以用于羊奶中羊源性成分特异性检测。

此外，乳制品在加工中DNA有所降解，为了解不同提取方法对羊乳DNA的适用性，在提取DNA时选用普通动物源性DNA提取试剂盒，Wizard磁珠法食品DNA富集提取等方法进行比较，结果证明当模板DNA含量低时，利用磁珠富集法提取更适合于乳制品的检测。

2.2 Taqman实时荧光定量PCR对羊乳中DNA检测灵敏度

验证Real-time PCR法能够检测出牛、羊乳中DNA质量浓度的最低值，考虑到乳制品中复杂体系及乳细胞分布不均的情况，并且市售产品多为直接将牛乳掺入羊乳中，因此采用将不同比例牛乳掺入羊乳中为样品，稀释成浓度梯度为含牛乳比例100%、50%、10%、5%、2%与1%，结果证明，当掺入2%牛乳时ct值为32.25，当浓度为1%时，无扩增曲线，因此最低掺假检测灵敏度为2%。如图3。

3 结语

本文依据羊线粒体基因的差异设计了特异性引物和探针，建立了快速鉴别羊乳掺假的Taqman实时荧光定量PCR检测方法，最低掺伪检出限为2.0%，并选用磁珠法提取，能够较好的满足市售掺伪产品鉴别的需求。此法特异性高、灵敏度强，能够准确检测羊乳制品中羊源性、牛源性成分，为市售商品的监管提供快速准确的技术手段。

参考文献

[1]Ceballos l s， Morsles e r， Asarve g t， et al.Composition of goat and cow milk produced under similar conditions and analyzed by identical metyodology[J]. Journal of Food Composition and Analysis， 2009， 22（4）：322-329.

[2]Mininni a， Pellizzari c， Cardazzo b， et al.Evaluation of real-time PCR assays for detection and quantification of fraudulent addition of bovine milk to caprine and ovine milk for cheese manufacture[J]International Dairy Journal，2009，19（10）：617-623.

[3]Park YW，M.Juarez b， M Ramos，et al.Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk[].Small Ruminant Research，2007，68（1）：88-113.

[4]Park YW.Hypo-allergenic and therapeutic significance of goat milk [J]. Small Rumin Res，1994，14（14）：151-159.

[5]Koppel R，Jurg R. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef，pork，horse and sheep[J]. European Food Research and Technology，2011，232（6）：151-155.

[6]黎穎，巫贤，林波，等.羊乳及其制品中掺入牛属牛乳和水牛乳的检测[J].基因组学与应用生物学，2015（5）：977-981.

作者简介：张艳茹（1988—），女，满族，内蒙古包头人，本科，助理工程师。研究方向：分子生物技术检测。