段如冰，梁晓东，梁辉洪，娄 娟，郭江华

广东省江门市中心医院生殖医学诊疗中心，广东江门 529000

近三十年来，人类生殖医学是发展最快、最活跃和最富有成果的学科之一。由于环境污染、过度晚婚晚育等因素，人类的生育力呈下降趋势，不孕不育的发病率逐年上升[1-2]。胚胎质量是影响临床治疗不孕症结局的重要因素之一，将卵裂期胚胎继续培养至囊胚阶段能获得更高的种植率[3-4]，故囊胚冷冻技术对治疗不孕症结局尤为重要。单囊胚移植可以有效降低多胎率[5-6]，降低胎儿和产妇的风险，是移植策略的必然趋势。囊胚腔中液体较多，冷冻保护剂不能充分渗透到细胞内，导致冰晶形成，进而损伤细胞[7]。基于激光的人工皱缩技术能在囊胚玻璃化冷冻前使囊胚腔塌陷，避免了由冰晶引起的细胞冷冻损伤。但是激光人工皱缩对单个囊胚玻璃化冷冻后的发育潜能的影响尚未阐明。本研究采用回顾性队列研究，探讨单个囊胚经激光人工皱缩后行玻璃化冷冻-解冻对移植结局的影响，为单囊胚解冻移植策略提供理论参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2011年12月至2018年12月在广东省江门市中心医院生殖医学诊疗中心就诊的508例不孕症女性为研究对象。纳入标准：(1)体外人工授精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)患者，年龄<39岁。(2)遵医嘱及患者意愿行囊胚培养，所得到囊胚经玻璃化冷冻保存。(3)囊胚解冻后移植1个囊胚的患者。(4)观察周期均为第一次取卵周期。(5)患者对本研究充分知情同意，自愿参与，并签署知情同意书，且允许其数据被匿名用于临床科学研究。排除标准：(1)供卵、移植前基因诊断(PGD)/移植前基因筛查(PGS)、卵子体外成熟(IVM)的周期。(2)经皮睾丸精子抽吸术(TESA)/经皮附睾精子吸取术(PESA)来源的精子授精后获得的囊胚。

本研究为回顾性队列研究，研究对象分为皱缩组和对照组，皱缩组患者的囊胚采用激光打孔皱缩后再玻璃化冷冻(222例)；对照组患者的囊胚未行皱缩直接玻璃化冷冻(286例)。

1.2方法

1.2.1控制性超促排卵与囊胚评分 控制性超促排卵按本中心常规操作进行[8]。患者胚胎在37 ℃、6%CO2、5%O2的环境中，用G-1和G-2培养液(Vitrolife，瑞典)进行序贯培养，根据胚胎和患者情况决定第3天或第5天移植。第3天移植或冷冻后剩余的胚胎经患者知情同意后行囊胚培养。分别于第5天、第6天观察，采用 Gardner评分方法对囊胚进行评分；将移植完剩余的符合冷冻标准的囊胚进行冷冻保存。移植或者冷冻保存的囊胚标准：≥3期，内细胞团或滋养层细胞至少有1个在C级以上，不包括内细胞团细胞及滋养层细胞均为C级者。子宫内膜准备包括自然周期、激素替代周期和促排卵周期3种方案。

1.2.2激光打孔皱缩囊胚 皱缩组在囊胚冷冻前进行激光打孔，使扩张囊胚皱缩。具体过程如下：采用RI激光破膜系统(Saturn Active，英国)对扩张囊胚行激光打孔，使用单一的激光照射(409 μs)滋养细胞较薄弱区(远离内细胞团)打孔，囊腔迅速皱缩，水分流出，囊胚放回培养箱中，5～10 min后囊胚腔完全收缩，立即使皱缩的囊胚玻璃化冷冻，并储存在—196 ℃液氮罐中。对照组囊胚直接行玻璃化冷冻。

1.2.3囊胚冷冻与复苏 皱缩组与对照组囊胚冷冻、解冻试剂均选择日本Kitazato冷冻及解冻试剂盒，操作方法参照其说明书[9]。

1.3观察指标 (1)比较两组患者的优胚率，将囊胚发育至≥3期，内细胞团和滋养层细胞均≥B级定义为优质囊胚；(2)比较两组患者临床妊娠率、生化妊娠率、种植率、流产率及异位妊娠率。移植12 d后查患者血、尿人绒毛膜促性腺激素(HCG)，若呈阳性且第35天行超声检查见到孕囊，并有心管搏动则判定为临床妊娠。

2 结 果

2.1两组患者临床资料比较 两组患者的年龄、不孕年限、内膜厚度及内膜准备方案等比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2两组患者移植结局比较 两组患者的临床妊娠率、优质囊胚率、生化妊娠率、种植率、流产率和异位妊娠率，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 两组患者临床资料比较

表2 两组患者移植结局比较

3 讨 论

影响囊胚玻璃化冷冻的因素很多，如冷冻前囊胚的选择、冷冻载杆、人工皱缩、辅助孵化及复苏后扩张速度等[10-11]。既往研究显示，囊胚腔大小与冷冻复苏后的囊胚存活率呈负相关，因为囊胚腔内含有大量液体，若脱水不充分易形成细胞内冰晶，造成胚胎冷冻损伤[12]。DESAI等[13]的研究显示，皱缩组与未处理组在存活率、复苏率上差异无统计学意义(P>0.05)，皱缩组仅在复苏后囊胚的扩张速度上较快。本研究也显示，皱缩组的临床妊娠率、优质囊胚率、生化妊娠率、种植率、流产率、异位妊娠率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。这可能与商业化的玻璃化冷冻体系日渐成熟有关(细胞脱水置换充分、冷冻载杆薄、降温迅速)。

由于激光人工皱缩技术在临床上应用的时间较短，尚无大量的随访数据证明其对子代围生期和新生儿结局是否存在影响；且未经皱缩的囊胚冷冻复苏后也能达到理想的妊娠结局，故建议在单囊胚冻融移植中将不经人工皱缩的玻璃化冷冻作为患者的首选方案。需要指出的是，由于本研究是在单中心数据上进行的，故上述结论仍需要更大样本量的多中心研究进行证实。