万梦弟，尤艳

（哈尔滨医科大学附属第四医院，黑龙江哈尔滨150001）

恶性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）简称恶黑，是来源于黑色素细胞、恶性度极高的疾病，其五年生存率从Ⅰ期的95%降至Ⅳ期的不足10%[1]。恶黑已成为皮肤癌致死疾病的首位，其中浸润和转移是导致患者死亡的主要因素。目前研究表明，MM发病有多因素、多步骤、逐步变化的特征：由正常上皮黑色素细胞增殖，继而向真皮层侵袭，最后发展为MM，其中分子水平的变化是关键[2]研究显示基质金属蛋白酶（MMP）显著促进癌细胞的迁移[3]，MMP-2与MMP-9是MMP家族中的重要成员，对癌细胞的侵袭和转移发挥着重要作用。因此，本研究应用免疫组化方法观察MM组织中MMP-2和MMP-9的表达情况以及结合统计学分析其阳性表达与患者生存期的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 52例MM患者（试验组）、20例色素痣患者（对照组）标本均来自于2010～2015年哈尔滨医科大学肿瘤医院病理科确诊的石蜡包埋组织块，全部病例术前均未采取放、化疗等任何干预措施，且全部经过皮肤科2位病理医师共同确认，所有病例从术后随访至2018年9月1日记录其生存期，期间患者死亡随访停止，收集52例MM患者的生存时间、生存结局及影响因素（性别、年龄、MMP-2、MMP-9）。试验组其中男 29 例，女 23 例，年龄25～78岁，平均58岁；对照组男8例，女12例，年龄21～76岁，平均52岁。

1.2 主要试剂及仪器 兔抗人MMP-2、MMP-9单克隆抗体购自武汉博士德公司，SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中山生物公司，石蜡切片机为上海美盛生产的LEICA RM 2125，摄影显微镜为日本光学工业株式会社生产。

1.3 实验方法及步骤 免疫组化SP法检测MMP-2、MMP-9。实验步骤：石蜡切片脱蜡至水，切片放入缓冲液中微波炉加热15 min进行抗原热修复，加3%H2O2孵育20 min阻断内源性过氧化物酶，分别滴加 MMP-2、MMP-9 一抗工作液（工作浓度 1∶100）4℃冰箱过夜，然后按说明书进行DAB显色，显微镜下双蒸水终止显色，苏木素复染3 min，梯度酒精脱水后树胶封片，上镜读片。

1.4 结果判断 MMP-2和MMP-9表达于细胞浆和细胞膜上，随机选取5个高倍镜（40×）视野阅片，采用免疫反应积分法（Immuno-reactive score，IRS）[4]进行综合判断，IRS=阳性细胞百分比积分×阳性细胞染色强度积分，阳性细胞百分比积分标准：根据显微镜下阳性细胞所占百分比积分，未着色0分，1%～10%为 1分，11%～25为 2分，26%～50%为 3分，＞50%为4分；阳性细胞染色强度计分标准：无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。IRS＞4为阳性，≤4为阴性。所有结果都由2位皮肤病理医师双盲阅片。

1.5 统计学处理 应用SPSS 19.0对实验数据进行统计学分析。MMP-2和MMP-9在MM与色素痣中表达差异采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义；性别、年龄、MMP-2和MMP-9在MM表达与预后关系采用多变量Cox回归分析，校正性别、年龄因素后应用Kaplan-Meier法绘制MMP-2与MMP-9生存率曲线，之间的差异应用Log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1A MMP-2在MM组织中的表达

2 结果

2.1 MMP-2、MMP-9在MM、色素痣中的表达 MMP-2在MM组织中阳性表达率为80.8%（42/52），色素痣为 10%（2/20），二者差异有统计学意义（χ2=30.440，P＜0.01），见表 1，图 1A；MMP-9 在 MM 组织中阳性表达率为 76.9%（40/52），色素痣为 15%（3/20），二者差异有统计学意义（χ2=23.025，P＜0.01），见表 1，图1B。

2.2 MMP-2和MMP-9在MM中表达率的差异性 MM中组织中MMP-2和MMP-9双阳性表达为34例，双阴性为4例，配对四格表资料比较二者在MM中的表达率差异无统计学意义（χ2=0.07，P＞0.05），见表2。

2.3 将性别、年龄、MMP-2、MMP-9进行多变量Cox回归分析，结果显示只进行了MMP-2和MMP-9两步回归，说明年龄和性别与MM生存时间无明显相关性；MMP-2（B=1.879）、MMP-9（B=1.489）阳性二者的回归系数 B＞0，MMP-2（HR=6.546，95%置信区间为 1.543～27.774）、MMP-9（HR=4.434，95%置信区间为1.623～12.114）蛋白阳性二者的风险比HR＞1，说明二者是威胁MM患者死亡的危险因素；在MMP-9表达相同的情况下，MMP-2表达会使MM患者死亡率提高6.564倍；在MMP-9表达相同的情况下，MMP-2表达会使MM患者死亡率提高4.434倍，见表3。

表1 MMP-2、MMP-9在MM及色素痣组织中的表达情况

图1B MMP-9在MM组织中的表达

表2 MMP-2和MMP-9在MM中表达的差异 例

表3 MMP-2、MMP-9与MM患者预后的多变量Cox回归分析

2.4 单因素Kaplan-Meier法分析显示MMP-2阳性表达的MM患者的生存期显著低于阴性者（均P=0.004），生存曲线如图 2A；同样，MMP-9 阳性表达的MM患者的生存期也显著低于阴性者（均P＜0.001），生存曲线如图 2B。

3 讨论

MMP-2和MMP-9是2个重要的金属蛋白酶超家族成员，参与广泛的蛋白水解事件，包括肿瘤生长，迁移，转移和血管生成。You等[5]研究显示MMP通过降解细胞外基质从而促进MM细胞的侵袭和转移。本研究显示，在MM组中MMP-2表达率（80.8%）、MMP-9表达率（76.9%）均明显高于色素痣组（P＜0.01），提示二者在MM病情发展中发挥着重要作用，这与国内万慧颖等[6]研究报道相一致。但导致基质金属蛋白酶高表达的原因尚无明确报道。国外Preisner等[7]的体外研究表明来源于人类脂肪组织的干细胞可使MMP尤其是MMP-2的表达水平增加，但真正在MM患者体内有怎样的分子生物学变化，现在还不得而知。本实验结果显示MMP-2和MMP-9双阳性表达的病例数高达30例（50.69%），应用配对四格表资料的χ2检验分析其二者在MM中表达的阳性率差异无统计学意义，这不能排除二者之间表达是否有相关性。Jiang等[8]的研究发现乳腺癌细胞通过FAK/Akt/ERK和NF-κB信号通路下调MMP-2/-9的表达。但文献尚无报道二者在基因及分子水平表达过程中是否有交叉。此外，本研究应用多因素逐步Cox相关分析，排除年龄及性别因素后，发现MMP-2与MMP-9是影响MM患者预后的独立危险因素，而且在MMP-9表达相同的情况下，MMP-2表达会使MM患者死亡率提高6.564倍；在MMP-9表达相同的情况下，MMP-2表达会使MM患者死亡率提高4.434倍。而且单因素分析显示，MMP-2与MMP-9阳性表达患者的生存期明显短于阴性者，其表达显著增加患者死亡风险，提示MM患者MMP-2和MMP-9的表达水平在评估患者预后中可能有潜在价值，有望成为临床医师评估患者预后的重要指标。本研究样本量偏小，今后需要更大的数据去验证本次实验结果的准确性。另一方面，病例资料全部来源于黑龙江省，因MM发病有遗传因素[9]，所以本实验研究不能排除基因易感性造成的偏倚，而且变量较少，应收集更多资料，多因素分析，从而增强预后评估的准确性。

图2 MMP-2、MMP-9生存率曲线

通过本次研究，笔者发现MMP-2及MMP-9在MM组织中高表达，且二者是影响MM患者预后的独立危险因素。Ahmad等[10]研究报道了肾癌患者MMP-2、MMP-9血清学的变化可以用作早期疾病诊断的生物标志物，也可用于监测疾病复发。所以下一步计划应用前瞻性研究，收集MM以及色素痣患者术前、术后MMP-2、MMP-9血清学数据，分析其用作早期疾病诊断以及监测疾病复发的可行性；继续深入探究MMP高表达的原因及途径有望为治疗MM提供新的思路及靶点。