王 欢，张红星，金君华，谢远红

(北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心/农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京102206)

细菌素(bacteriocins)是某些细菌产生的具有抑菌生物活性的多肽、蛋白或蛋白复合物[1]。其作为一种安全高效的天然生物抑菌剂，近年来在食品保藏和抑菌类药物开发等行业的应用受到极大的关注。由乳酸菌代谢所产的细菌素被称为乳酸菌素，是一种安全的蛋白类物质[2]，同时可抑制单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌和沙门氏菌等致病菌[2-3]以及腐败菌的生长。乳酸乳球菌素Nisin和乳酸片球菌素Pediocin是目前大规模商业化应用的乳酸菌细菌素，已经被80多个国家和地区允许作为食品添加剂，应用在奶酪、牛奶制品、果汁和罐头等食品生产中[4]。针对食品中乳酸乳球菌素Nisin的检测方法，1990年建立第一种乳酸乳球菌素Nisin免疫试验，即酶联免疫吸附试验。使用制备的羊抗乳酸乳球菌素Nisin的多克隆抗体，能够检测到溶液中5 ng/mL的乳酸乳球菌素Nisin，检测到奶酪中231 ng/g的乳酸乳球菌素Nisin[5]。

前期研究中，本课题组从天然发酵的肉制品中筛选得到1株植物乳杆菌BM-1(LactobacillusplantarumBM-1)。通过体外抑菌试验证实，植物乳杆菌BM-1能够代谢产生一种对单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、志贺氏菌(Shigelladysenteriae)等都具有一定抑菌效果的细菌素蛋白，命名为植物乳杆菌素BM-1[5]。由于植物乳杆菌素BM-1对多种食源性致病菌都具有一定的抑菌效果，且热稳定性良好，在pH 2.0～10.0范围内均具有良好的抑菌活性，相对于乳酸乳球菌素Nisin在食品防腐保鲜领域具有更为广阔的应用前景。

植物乳杆菌素作为一种新型的IIa类乳酸菌素，目前限制其在食品保鲜应用中存在的最大问题是，还没有建立食品中植物乳杆菌素的定量检测方法。由于植物乳杆菌素BM-1是一种蛋白，因此建立针对植物乳杆菌素BM-1的免疫学定量检测方法显得尤为重要。本研究的目的是制备高滴度的植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体，为进一步建立酶联免疫吸附试验检测植物乳杆菌素BM-1的方法奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组免疫原pKYCS-KLH、pKYCS-BSA(上海强耀生物技术有限公司)，小鼠SP2/0骨髓瘤细胞(食品质量与安全北京实验室保存)，鼠单抗亚型鉴定试剂盒(Sigma公司)。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DYY-6DCP-32B型恒流电泳仪(北京六一仪器厂)，酶标测定仪(Bio Rad公司)，BT2202S电子天平(Starorius公司)，BIOFUGE STRATOS台式冷冻离心机(Theromo公司)，2000微量分光光度计(Theromo公司)。

1.3 方 法

1.3.1 植物乳杆菌素BM-1抗原制备 根据Atrih[6]研究，按照植物乳杆菌素BM-1的氨基酸序列，合成植物乳杆菌素BM-1成熟肽，全序列为KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAM AWATGGHQGNHKC。并委托上海强耀生物技术有限公司将合成的植物乳杆菌素BM-1分别偶联钥孔血蓝蛋白和牛血清白蛋白制备得到人工抗原pKYCS-KLH和人工抗原pKYCS-BSA，用于后续免疫试验动物。

1.3.2 人工抗原动物免疫 将人工抗原pKYCS-KLH按60 μg蛋白/只小鼠的量与等体积的完全弗氏佐剂混合，皮下注射初次免疫4只无特定病原体级(SPF级)的Balb/c雌性小鼠。每隔15 d加强1次免疫，按照30 μg蛋白/只小鼠的量共加强4次，之后进行眼眶取血，采用间接酶联免疫吸附试验测其血清效价。

1.3.3 间接酶联免疫吸附试验检测抗体滴度 取制备的人工抗原pKYCS-BSA加入到包被缓冲液(0.02 mol/L Na2CO3，0.03 mol/L NaHCO3，pH 9.6)中，终浓度为10 mg/mL。取100 μL包被缓冲液，加入到96孔板，于4 ℃包被过夜，弃去孔内液体，洗涤3次后于室温晾干。每孔加入200 μL封闭液(10%小牛血清)，37 ℃温育1 h，弃去孔内液体，洗涤3次并于室温晾干。将待测血清用稀释液(0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.2)从200倍稀释液开始进行连续的二倍梯度稀释，一直到稀释倍数为102 400倍。于96孔板中每孔加入不同稀释度的血清100 μL，并且将阴性血清做阴性对照，稀释液做空白对照，用于消除稀释液对反应的影响。37 ℃温育45 min，弃去孔内液体，洗涤3次后于室温晾干。把酶标二抗稀释成1∶20 000，100 μL/孔加入酶标板，37 ℃温育30 min，弃去孔内液体，洗涤3次后于室温晾干。96孔板中每孔加入100 μL显色液，37 ℃温育10 min。每孔加入50 μL终止液，使用酶标仪检测450 nm波长下的吸光值(OD值)。结果判定：检测孔OD值大于或等于2倍阴性OD值(P/N)的最高抗体稀释倍数为检测样品抗体的滴度。

1.3.4 细胞融合及阳性细胞筛选 于融合前3 d向最佳免疫小鼠脾脏注射20 μg免疫原加强免疫。断颈处死小鼠，分离小鼠脾脏，轻轻刮取脾细胞。取同时培养的人骨髓瘤细胞SP2/0，两者按10∶1比例混合，缓慢加入聚乙二醇，进行两种细胞的融合，使其充分反应后，用培养基洗2遍，最后溶于Dulbecco's Modified Eagle Medium-HAT培养基中，于5% CO2培养箱中37 ℃培养6 d。将培养板中液体换为 Dulbecco's Modified Eagle Medium-HT培养基，于5% CO2培养箱中37 ℃培养24 h。取细胞上清液，进行间接酶联免疫吸附试验检测，阳性孔即分泌抗体的细胞孔，标记为阳性细胞克隆。针对阳性细胞克隆进行二倍梯度稀释，进行单细胞培养。连续培养5代，分别检测每一代上清效价，如均为阳性则为筛选得到的分泌抗植物乳杆菌素BM-1的杂交瘤细胞株，于-80 ℃保存。

1.3.5 植物乳杆菌素单克隆抗体亚型鉴定 用100 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4稀释pKYCS-BSA包被抗体至0.5 μg/mL，于96孔板中每孔加 100 μL稀释液，4 ℃反应过夜。弃去孔中的液体，使用磷酸盐缓冲液洗涤3次，于每孔中加入 200 μL封闭液，37 ℃孵育2 h。弃去孔中的液体，使用含有0.05%吐温-20磷酸盐缓冲液洗涤3次，于每孔中加入100 μL杂交瘤细胞上清，37 ℃孵育1 h。弃去孔中的液体，使用0.05%吐温-20磷酸盐缓冲液洗涤3次，每孔中加入100 μL用辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育1 h。弃去孔中的液体，使用0.05%吐温-20磷酸盐缓冲液洗涤3次，每孔中加入50 μL显色底物，显色10 min。酶标仪450 nm波长下检测吸光值(OD450)。

1.3.6 植物乳杆菌素单克隆抗体的纯化及定量 取培养的杂交瘤细胞腹腔注射Balb/c雌性小鼠，7 d后于腹腔收集腹水。取5 mL腹水与15 mL 磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L pH 7.0)混匀后，逐滴加入500 μL辛酸，磁力搅拌30 min，4 ℃静置2 h。用滤纸过滤得到上清液加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L pH 7.0)，并向液体中缓慢加入硫酸铵，磁力搅拌30 min，使硫酸铵达到65%，4 ℃静置2 h，4 ℃条件下12 000 r/min离心30 min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L pH 7.0)溶解并在4 ℃条件下透析去除硫酸铵，冷冻干燥纯化的单克隆抗体，并于-20 ℃储存。采用核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000C，Thermo公司)检测植物乳杆菌素单克隆抗体的蛋白浓度。

1.3.7 蛋白电泳检测单克隆抗体纯度 取纯化的植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体与2×三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)样品缓冲液在1.5 mL离心管中混合，100 ℃加热5 min。制备Tricine-SDS凝胶，分离胶18%，浓缩胶5%。将凝胶置入电泳槽，向电泳槽加入1×Tricine-Tris-SDS电泳缓冲液，150 V电泳2 h，染色后采用光密度分析法检测蛋白纯度。

2 结果分析

2.1 间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清效价

采用制备的乳酸菌素人工抗原pKYCS-BSA免疫小鼠，免疫5次后于7 d后分别检测4只小鼠血清中乳酸菌素抗体效价，结果如表1所示。其中2号小鼠血清中乳酸菌素抗体效价最高，血清稀释倍数达到102 400时P/N值为2.8，显著大于1号小鼠的1.7，3号小鼠的1.1和4号小鼠的1.3。选择2号小鼠进行后续的细胞融合试验。

表1 小鼠血清效价分析Tab.1 Titer analysis of mice serum

2.2 细胞融合试验结果

细胞融合后，进行阳性细胞筛选，并采用酶联免疫吸附试验检测筛选的单克隆细胞产生抗体的效价。细胞进行1次96孔板的筛选，结果如表2所示。共筛选得到6株呈阳性的杂交瘤细胞，分别是E3、E5、E7、E9、F5、G4孔细胞，阳性率为6.45%。

选取6株阳性细胞连续培养10代，有限稀释法进行二次筛选，结果如表3所示。其中2株阳性细胞稳定性较好，按照吸光值大小最终筛选得到2株效价较高的单克隆细胞株E5和E9。

2.3 单克隆细胞亚类鉴定

选取筛选得到的2株单克隆细胞株E5和E9，进行亚型鉴定分析，结果如表4所示。E5和E9细胞株均为IgM类型的阳性杂交瘤细胞株。

2.4 植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体的纯化

将得到的杂交瘤细胞E5扩大培养，注射成年BALB/c小鼠腹腔，诱发腹水，获取腹水。经间接酶联免疫吸附试验检测，腹水效价为21.26×104。采用辛酸-硫酸铵法进行单克隆抗体的纯化试验，经蛋白纯化，蛋白质量浓度13.2 mg/mL，分析纯度达到92%。

表2 细胞融合试验筛选结果Tab.2 Screening results of cell fusion experiment

注：H12孔为阳性对照读数，G12为空白对照读数，F12为阴性对照读数；方框中的数字代表阳性孔数。

Note: H12 is the positive control reading, G12 is the blank control reading, and F12 is the negative control reading; positive well numbers are shown in box.

表3 阳性细胞株筛选结果Tab.3 Screening results of positive cell lines

表4 单克隆细胞亚类鉴定结果Tab.4 Identification of monoclonal cell subsets

采用Tricine电泳检测纯化的植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体，结果如图1。获得清晰的2条蛋白带，分别为单克隆抗体的重链和轻链。

注：M是预染蛋白Marker，1是植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体。Note: M is Pre-stained protein Marker, 1 is Plantaricin BM-1 monoclonal antibody.图1 植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体SDS-PAGE电泳图Fig.1 Electrophoresis analysis of planraricin BM-1 monoclonal antibody

3 讨 论

在前期研究中，本课题组从天然发酵食品中分离得到1株产乳酸菌素的植物乳杆菌BM-1，抑菌活性分析表明，植物乳杆菌素BM-1对多种食源性革兰氏阳性和阴性致病菌均具有良好的抑菌作用[4]。将其应用于冷鲜肉中微生物污染的控制研究中，发现植物乳杆菌素BM-1能够显著抑制冷鲜肉中单增李斯特菌的污染，并且有效降低冷鲜肉表面菌落总数[7]。目前，已经报道多种由植物乳杆菌代谢产生的细菌素应用于食品微生物污染控制。例如，植物乳杆菌素Plantaricin C19，是一种由植物乳杆菌C19产生的，具有抗单增李斯特菌作用的细菌素，在其N端含有的一段保守序列YYGNGV，结构分析表明其与乳酸片球菌素Pediocin的结构高度类似，能够显著抑制多种食源性致病微生物[6]。植物乳杆菌LR/14产生的抗菌肽LR14，对黑曲霉、匍匐根霉、总状毛霉和产黄青霉4种腐败真菌具有抑菌效果，并且在实验室条件下能提高小麦的储藏时间[8]。

关于细菌素的定量分析方法，目前主要有微量滴定法、比浊法和免疫学方法等。前2种方法更多的用于检测细菌素的活性，而免疫学方法用于定量检测细菌素蛋白的含量[9]。Suarez等[10]建立的直接竞争性酶联免疫吸附试验检测结果表明，使用小鼠来源的乳酸乳球菌素Nisin单克隆抗体的检测限明显高于使用多克隆抗体的检测限。Bouksaim等[11]利用酶联免疫吸附法检测细菌素。将乳酸乳球菌素Nisin包被于酶标板，并用亲和纯化的抗乳链菌肽抗体进行检测。为了减少非特异性结合，在酶标板上涂一层吐温-20。建立的酶联免疫吸附试验对纯乳酸乳球菌素Nisin更敏感，为研究细菌素的产生及其在食品货架期中的抗菌活性提供一种工具。[11]。

细菌素抗体的产生为细菌素的检测和定量提供特异和敏感的方法，使免疫化学分析成为可能。抗体的制备为利用免疫亲和层析法纯化细菌素提供可能的替代方法。而细菌素纯化率低是细菌素自身或结合载体蛋白免疫试验动物的主要缺点，之前成功的经验大多是采用合成的细菌素生产多克隆抗体或者单克隆抗体[12]。Keren等[12]合成的乳链球菌素RM免疫兔子制备细菌素多克隆抗体，得到抗体的滴度约为1∶140 000。Martínez等[13]用合成的植物乳杆菌素PA-1免疫兔子制备多克隆抗体，得到抗体的滴度约为1∶102 000，均远低于本研究制备的细菌素单克隆抗体的滴度。本研究同样采用合成的植物乳杆菌素BM-1制备人工抗原后免疫小鼠，并分离小鼠脾细胞进行细胞融合，筛选得到2株能够稳定分泌植物乳杆菌素BM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞E5免疫小鼠诱发腹水，抗体滴度在1∶200 000以上。本研究为进一步建立基于免疫学的植物乳杆菌素BM-1定量检测方法奠定研究基础。