北京地区羊肚菌栽培适应性研究

2020-05-18果禹鑫降玉清陈青君张国庆常俊凤

北京农学院学报 2020年3期

果禹鑫，降玉清，陈青君,*，张国庆,，常俊凤

(1.新疆农业大学林学与园艺学院，新疆乌鲁木齐 830052;2.北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206;3.河北省临西县农业技术推广中心，河北邢台 054900)

羊肚菌(Morchellaspp.)又称羊雀菌、羊肚蘑、包谷菌、麻子菌、狼肚等，是羊肚菌属真菌的统称，分类学上属于子囊菌门(Ascomycota)，盘菌纲(Pezizomycetes)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌属(Morchella)，因其子实体外观形似羊肚而得名，是一种珍稀的食药用菌。据报道，中国共有羊肚菌30多种，分布于21省市[1-2]。

羊肚菌受到栽培季节、土壤营养退化、病虫害、栽培成本多种条件的限制[3]，其产量低，价格昂贵。20世纪70年代人工栽培羊肚菌的研究就已经展开，大田栽培、设施化栽培等栽培模式应运而生[4]；朱斗锡等[5]在羊肚菌室内栽培方面取得成功，获得国家专利。由于气候条件限制，中国羊肚菌人工栽培大多集中在南方，目前在川渝等地区已经实现大田的规模化生产，其他地区也陆续开展适应性研究[6]。刘洁等[7]对冀北地区冬春季节羊肚菌暖棚设施栽培的最适条件进行探索并取得成功，确定出菇期气温应控制在16～20 ℃，空气湿度为85%～95%；张季军等[8]确定辽宁地区羊肚菌设施栽培的最适环境条件，原基生长期环境温度为10～17 ℃，湿度为75%～80%；杨春艳[9]经过探索，成功总结出山西地区羊肚菌盛产期在4—5月之间，温度在12～18 ℃是生长的高峰期，空气湿度为85%左右。李淑芳等[10]根据天津气候条件特征，针对大棚的设施情况，分析羊肚菌在天津的栽培时间和措施。贺国强等[11]在北京平原设施温室栽培羊肚菌也获得成功，但有关北京地区羊肚菌露地及山区的栽培情况尚未见报道。

北京地区野生羊肚菌资源分布在多个区域，但由于人为采集，野生资源逐年减少[12-13]。为了更好引种和人工栽培羊肚菌，了解羊肚菌不同菌株在北京不同环境下的生产性能，降低栽培羊肚菌风险，本试验在山区设施温室和平原露地两种环境条件下对羊肚菌的品种选择、菌丝体生长特性、环境温度、湿度和子囊果农艺性状进行对比、分析，以评价羊肚菌在北京地区的栽培适应性。

1 材料与方法

1.1 栽培品种

羊肚菌不同来源品种如表1所示。

表1 羊肚菌不同来源品种Tab.1 Artificial bacterium from different varieties of Morchella

1.2 培养基制作

1.2.1 母种制作马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。水煮沸后加入马铃薯，30 min后，用8层纱布过滤，将滤汁、葡萄糖和琼脂一并倒入锅中，持续搅拌加热，沸腾后分装试管，121 ℃高压灭菌30 min。灭菌结束后取出试管，斜放冷却。在超净工作台中挑取子囊果内侧菌盖与菌柄交界处接种在试管斜面。

1.2.2 原种及栽培种制作 78%棉籽壳，10%小麦，10%土，1%石灰，1%石膏，含水量65%。将原料充分混匀后放入500 mL广口瓶中压紧，使用封口膜和报纸封盖，121 ℃高压灭菌2 h，冷却后在无菌条件下接种，取一块原种接种在栽培种瓶口的中央。

1.2.3 外援营养袋制作及使用方法麦粒∶稻壳=1.45∶1(质量比)，石灰2%，含水量50%～60%(56%左右)。将原料按比例混合，加水浸泡，装袋灭菌。每平方米2袋，每1 m×7 m畦11袋，接触地面的一侧需用钉子打眼，钉子直径约3 mm,打眼孔数20～30孔。

1.3 土壤理化性质

取样方法：取土层5～10 cm处土壤，每个小区采用五点取样法。

土壤pH值和EC值分别用METTLER TOLEDO的Five Easy pH计，雷磁的DDSJ-308A电导率仪测定：水土比为10∶1，磁力搅拌器搅拌均匀后静置。含水量测定采用烘干称重法[14]。

1.4 栽培试验设计

8个羊肚菌品种分别在温室和露地进行播种。

1.4.1 温室品种试验温室品种试验在北京市延庆区四海镇日光温室进行。2016年10月1日播种，小区面积6 m2，重复3次，2016年10月20日盖棚膜。菌丝萌发至出菇前用遮阳网覆盖，出菇后沿大棚东西方向再悬挂遮阳网。子囊果开始分化时撤掉外援营养袋，记录不同品种的出菇情况；子囊果进入成熟期后保持温室通风并开始采收，平均每7 d采摘1次，采收期为70 d，测定子囊果长度，菌盖长度、宽度，单果鲜质量及干质量。比较并记录品种之间的差异。

1.4.2 露地品种试验露地品种试验在北京农学院苹果林地行间进行，2016年9月30日播种，小区面积6 m2，重复3次，并覆盖遮阳网，2016年11月17日覆盖塑料大棚膜。2017年3月下旬去掉塑料棚膜，用长3～4 m的竹竿搭建拱棚覆盖遮阳网；2017年3月上旬和3月下旬连续浇透水刺激子囊果分化。子囊果分化后撤掉外援营养袋。比较并记录品种之间的差异。

1.5 测定内容与方法

1.5.1 品种ITS鉴定将8个羊肚菌品种的子实体或者菌丝体按照新型植物基因组DNA提取(天根生化科技北京有限公司)试剂盒说明书的步骤操作，获得DNA产物。扩增5.8 S rDNA及其两侧的ITS1和ITS2基因片段，引物采用真菌ITS通用引物对ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[15-16]。将PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将已经获得的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8的ITS序列在NCBI进行BLAST比对(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)，选取相似科属但是不同株系的羊肚菌ITS序列，用Clustal_X软件对所得序列进行1 000次校正、比对分析，使用MEGA 6.0软件、用Neighbor-joining法构建系统进化树，进行同源关系比较与作图[17]。

1.5.2 菌丝体生长特性观察分别测定8个羊肚菌品种在原种、栽培种期间的菌丝生长速度、颜色、长势形态、菌丝密度、菌核密度等。

1.5.3 栽培环境及土壤的温度和湿度使用温湿度记录器在地表上方1 m处测定空气温度和湿度，将温湿度感应器插入试验地小区中心地表下方5 cm处测定土壤温度和湿度。日平均气温和日平均湿度的计算根据北京时间02:00、08:00、14:00和20:00共4次的记录求平均值[18-19]。

1.5.4 农艺性状观测每个品种使用游标卡尺随机抽取30个子囊果测量农艺性状，包括大小、质量，日期等。

2 结果与分析

2.1 试验地土壤理化性质

露地种植地的土壤理化性质参数为pH 7.66，EC值0.07，含水量为21.75%；温室种植地的土壤理化性质参数为pH 7.45，EC值0.07，含水量为23.45%。羊肚菌适合在中性、弱碱性的土壤中生长。种植地土壤pH和电导率均符合羊肚菌的种植条件。土壤含水量均低于羊肚菌生长出菇的要求，因此需要定期人工补水。

2.2 品种ITS鉴定

8个品种的序列长度都在750 bp左右，均属于黑色羊肚菌类群(Black morel group)；通过ITS序列构建的羊肚菌系统发育树可以看出，R3和R8在系统发育树中的亲缘关系与六妹(Morchellasextelata)较近，属于六妹；而其他品种的亲缘关系则与梯棱(Morchellaimportuna)较近，属于梯棱(图1、图2)。

注：M. Marker；1. R1；2. R2；3. R3；4. R4；5. R5；6. R6；7. R7；8. R8Note：M. Marker；1. R1；2. R2；3. R3；4. R4；5. R5；6. R6；7. R7；8. R8图1 PCR扩增产物的ITS电泳检测图Fig.1 The electrophoresis map of the amplified ITS fragment of PCR

图2 基于ITS序列构建的羊肚菌系统发育树Fig.2 Morchella Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

2.3 菌丝体生长特性

从原种菌丝长势来看，R4、R6、R8菌丝长势较好，R3相对较弱，而从栽培种观察菌丝长势则是R3、R4和引进品种R7、R8好一些。综合来看，R4和R8在原种和栽培种阶段生长状况较好(表2)。

表2 不同羊肚菌品种原种和栽培种长势观察(PDA，25 ℃)Tab.2 Morchella of different varieties of stock culture and spawn of observation (PDA, 25 ℃)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different small letters indicate significant differences (P<0.05).

2.4 栽培环境及土壤的温度和湿度

通过对羊肚菌生长过程中环境条件的监测，可以总结出在本地区的最适生长条件。山区(四海)温室羊肚菌菌丝萌发期为2016年10月6日到10月20日，空气日均温度在13～15 ℃，土壤日均温度在13 ℃左右，空气和土壤湿度均在75%左右。子实体萌发期是在2016年12月11日到2016年12月25日，空气日均温度在10～12 ℃之间，湿度在78%～88%之间，土壤日均温度在8～13 ℃之间，湿度在70%～85%之间。出菇旺盛期在2017年1月11日到2017年1月25日，也就是采收的第21到第28天，空气日均温度在8～10 ℃之间，湿度在84%～85%之间，土壤日均温度在8～9 ℃之间，湿度在75%～79%之间(图3)。

图3 温室羊肚菌温度和湿度变化Fig.3 Morchella changes of temperature and humidity in Greenhouse

在山区温室中，随着自然季节温度的变化，菌丝生长期和子实体萌发阶段温室可以调控的温度均在12 ℃上下，子实体生长的温度在8 ℃到10 ℃之间，且羊肚菌生长期间空气和土壤湿度均在75%以上；基本满足羊肚菌生长对温度和湿度的要求。

平原露地播种后30 d的最高土壤温度17.9 ℃，最低土壤温度5.5 ℃，日均土壤温度11.3 ℃，基本上适合羊肚菌对温度的需要。2016年11月下旬至2017年2月下旬土壤温度都在0 ℃以下，2017年2月中旬土壤温度开始高于0 ℃，2017年3月10日左右揭开塑料棚膜，进行浇水，刺激出菇，2017年3月下旬搭设遮阳棚。空气和土壤湿度的变化均以2017年1月下旬至3月下旬最低(图4)，表明北京冬季的干燥气候对羊肚菌土壤的湿度影响较大，2017年4月出菇期空气温度变化范围在10～25 ℃，空气湿度的变化范围在23%～69%，土壤温度变化范围在5～18 ℃之间，土壤湿度变化范围在20%～87%之间。可以看出露地条件下环境温度和湿度变化范围很大，第二年出菇期的人工调控难度较大。

图4 露地羊肚菌温度和湿度变化Fig.4 Morchella changes of temperature and humidity in Open field

2.5 温室羊肚菌子实体农艺性状分析

菌盖的直径、长度，子囊果长度和单个子囊果质量可以反应羊肚菌的商品性状(图5、表3)。

图5 温室羊肚菌不同品种子囊果形态Fig.5 Greenhouse Morchella capsule form fruit seeds of different products

8个品种产量从大到小排序，依次为：R7>R6>R4>R2>R5>R1>R3>R8。六妹品系R3、R8的产量均低于梯棱品系，说明温室环境下，梯棱系产量较六妹高，更适用于温室种植。

从子实体的外观分析，菌盖较宽的为R1、R5、R8，菌盖较长的为R1、R3、R7，子囊果外形较大为R1、R7、R8，因此，从外形来看R1、R7和R8商品性状更好。8个品种按照子实体单个鲜质量从大到小依次为：R3>R1>R2>R5>R6>R7>R4>R8。综合来看，R1的商品性状最好，其次是R5。虽然R3子实体单个鲜质量最大，但是产量太低，不适用于温室种植。

从子实体出现的早晚分析，R2和R8最先成熟，R3成熟较晚。R1的出菇持续时间较为短暂，R8虽然可以持续较长时间出菇，但出菇数量渐减；品种R3出菇持续时间最长。

综合分析，R2、R4、R6、R7这4个品种产量较高，其中R7最高，产量为2 070 kg/hm2，R6、R4次之，R8最低；R3、R8虽然出菇持续期长，但产量较低；R6前期产量较高，R2后期产量较高。R7在品种、产量、商品性状方面表现最好，为最佳品种。

露地条件下温度和湿度变化较大，对羊肚菌生长不利，如表3所示，在平原露地条件下种植的羊肚菌只有3个品种出菇，产量高低为R8(1 290 kg/hm2)>R7(912 kg/hm2)>R3(339 kg/hm2)。六妹系均出菇，但梯棱系只有1个品种出菇，说明六妹品种更能适应极端天气，而梯棱在环境较好的温室表现好于六妹。

表3 羊肚菌不同品种农艺性状Tab.3 Different varieties of agronomic traits of Morchella

注：露地只有R3、R7和R8 这3个品种出菇；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Only three varieties of R3, R7 and R8 have grown mushrooms in the open field; Different small letters indicate significant differences (P<0.05).

3 讨论

由于羊肚菌栽培品种、技术的可重复性低，且室外羊肚菌栽培属于仿生态栽培方法，易受自然界天气变化的影响[20]，人为控制环境条件难度很大；同时，过低的温度会导致菌丝冻伤[21]，影响羊肚菌的正常生长，因此本试验露地栽培的8个羊肚菌品种出菇状况并不理想，北京地区露地栽培3—4月的温度调控非常关键，如何在这个时期适当增加降温和保湿的设施是获得高产的关键。

虽然露地栽培的羊肚菌出菇效果不理想，但试验中的六妹品种均实现正常出菇，说明六妹系更能适应极端环境条件，可以室外栽培。同时，通过对羊肚菌在两种环境条件下产量的比较，露地条件下的产量明显低于温室条件，结合北方地区冬季寒冷的气候状况可以得出一个结论：北京地区羊肚菌的冬季栽培更适合在设施内进行。

六妹羊肚菌具有明显抗极端环境的特性，同时也存在菌柄略长，鲜菇肉质松软、易碎，商品性状远不及梯棱羊肚菌[22]等问题，因此，虽然六妹羊肚菌的露地环境适应性较梯棱羊肚菌更好，但后者依旧更适合目前的商业生产。

果禹鑫等[23]在北京地区进行人工栽培羊肚菌播期及覆盖物试验中得出：露地出菇期的最高气温在20 ℃左右，土壤温度在3～10 ℃，土壤湿度在50%～75%之间。贺国强等[11]曾指出，菌丝生长最适宜温度为15～22 ℃，子囊果分化温度为10～12 ℃，子囊果最适宜的发育温度为12～16 ℃。本试验菌丝生长期和子囊果分化期的环境温度在12 ℃左右，出菇期环境温度在8～13 ℃，略低于文献[11,23]中结果，说明羊肚菌的生长温度变化大，本试验为室内栽培提供更多选择。