贾慧慧，王超男，魏艳敏，赵晓燕，高坦坦，任争光*

(北京农学院a.农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心，b.农业农村部华北都市农业重点实验室，北京102206)

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)普遍存在于植物的根际土壤中，具有绿色、抑菌谱广、耐储藏、耐逆境等特点，是植物保护工作者进行生物防治研究的一类重要微生物[1]。解淀粉芽胞杆菌能够合成多种抗菌代谢产物，其中，以非核糖体合成的聚酮化合物、脂肽化合物和核糖体合成的细菌素为主[2-3]。利用这些抗菌代谢产物，解淀粉芽胞杆菌能够抑制多种病原真菌和细菌的生长。另外，解淀粉芽胞杆菌与植物的相互作用可诱导植物产生诱导系统抗性(Induced systemic resistance, ISR)，使植物抗病性增强[4]。北京农学院植物保护实验室前期从杏树根际土壤分离到一株解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)BJ-6，研究发现该菌株及其发酵液对苹果树皮腐烂病菌(Valsamali)、苹果轮纹病菌(Physalosporapiricola)、桃褐腐病菌(Monilinialaxa)和白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)等多种病原真菌具有很强的抑菌活性[5-6]。本研究对解淀粉芽胞杆菌BJ-6全基因组进行测序、基因预测与功能注释，分析抗菌代谢产物的合成基因簇，并验证部分抗菌物质合成基因的表达，为今后深入研究该菌株的拮抗机制提供保障。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株B.amyloliquefaciensBJ-6分离自北京市门头沟区杏树根际土壤，北京农学院植物保护实验室保存。供试LB培养基配方为酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min；NB培养基配方为牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，调节pH至7.0，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 细菌总DNA和RNA的提取 将解淀粉芽胞杆菌BJ-6用LB培养基于28 ℃、200 r/min培养36 h，收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒(购自北京博迈德基因技术有限公司)提取总DNA。将解淀粉芽胞杆菌BJ-6菌株接种到NB培养基中，于28 ℃、200 r/min培养60 h，并分别于12、24、36、48、60 h时取样，利用细菌RNA提取试剂盒(购自北京博迈德基因技术有限公司)提取解淀粉芽胞杆菌BJ-6不同时间段的总RNA。

1.2.2 基因组测序与组装 细菌DNA检测合格后送北京赛默百合生物科技有限公司进行全基因组测序。采用全基因组鸟枪法(Whole-genome shotgun, WGS)，构建不同插入片段的文库，基于illumina MiSeq测序平台进行测序，获得的原始数据采用Edena软件进行组装[7]。

1.2.3 基因预测及注释 使用Prodigal软件对序列的蛋白编码区(Coding sequence, CDS)进行预测，使用Infernal、Rnammer软件对tRNA、rRNA和ncRNA进行预测[8-9]。使用RFam、Nr、KEGG、Swissprot和Nt数据库对所有基因进行比对和功能注释[10-11]。通过antiSMASH软件进行抗菌次级代谢产物基因簇的预测[12]。

1.2.4 抗菌代谢产物主要合成基因转录分析 将1.2.1中提取的总RNA利用反转录试剂盒反转录成cDNA。反转录体系为20 μL，包括反转录酶缓冲液4 μL、反转录酶1 μL、Oligo(dT)引物1 μL、随机核苷酸引物1 μL。反转录程序为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，使得反转录酶失活，最后4 ℃保存。根据次级代谢产物抗菌基因簇的预测结果，以cDNA为模板，设计7对引物(表1)分别扩增抗菌代谢产物(丰原素、杆菌素、大环内酯抗生素、杆菌溶素、儿茶酚型嗜铁素、表面活性素和伊枯草菌素)合成相关基因的部分序列(200 bp左右)；设计1对引物(表1)扩增细胞壁组分糖醛酸磷壁酸质的合成基因作为对照；同时以解淀粉芽胞杆菌BJ-6总DNA为模板作为对照进行扩增。分析不同培养时间段(12～60 h)抗菌代谢产物合成基因的转录表达情况。

表1 用于扩增解淀粉芽胞杆菌BJ-6抗菌代谢产物合成基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for amplifying biosynthesis genes of antibiotic metabolite

2 结 果

2.1 解淀粉芽胞杆菌BJ-6基因组序列结构特征

经过全基因组测序，序列拼接比对和注释分析，最后得到解淀粉芽胞杆菌BJ-6的全基因组序列4 175 709 bp。该序列GC含量为46.12%，预测的蛋白编码区(CDS)为4 075个；最后注释基因4 261个，包括87个tRNA基因、13个rRNA基因、1个tmRNA和85个miscRNA基因；基因间区占12.04%，基因的平均长度862 bp，基因的GC含量平均为47.21%；基因间区GC含量为38.22%，基因间区平均长度118 bp；共找到154个串联重复区域，10个IS序列，5个噬菌体元件。将解淀粉芽胞杆菌BJ-6与已公开发表解淀粉芽胞杆菌FZB42(GenBank登录号：CP000560)[13]进行比较，相对于FZB42，解淀粉芽胞杆菌BJ-6基因组较大，编码蛋白基因数量也多，而GC含量、编码区占比和IS序列数量基本一致(表2)。

表2 解淀粉芽胞杆菌BJ-6全基因组序列基本特征及菌株FZB42的对比结果Tab.2 The features of whole genome sequences of B. amyloliquefaciens BJ-6 and FZB42

2.2 主要代谢途径功能基因分析

KEGG分析解淀粉芽胞杆菌BJ-6基因组中主要代谢途径基因，有20种主要代谢通路，对参与各代谢通路的基因数量进行统计，见图1。参与氨基酸代谢和碳水化合物代谢的基因较多，都在200个以上；其次是参与跨膜运输、辅助因子和维生素代谢的基因；萜类和聚酮化合物，以及其他次级代谢物生物合成的数量共有74个，其中包括该菌株产生抗菌物质的合成基因。

图1 解淀粉芽胞杆菌BJ-6主要代谢通路注释统计Fig.1 Annotation graph of B. amyloliquefaciens BJ-6 protein encoding gene KEGG pathway

2.3 抗菌代谢产物基因簇的分析

通过antiSMASH软件对解淀粉芽胞杆菌BJ-6抗菌代谢产物编码基因簇进行预测(表3)。在解淀粉芽胞杆菌BJ-6全基因组中预测到7个抑菌代谢产物编码基因簇，其中丰原素、杆菌溶素、表面活性素，儿茶酚型嗜铁素和伊枯草菌素是通过非核糖体途径(Nonribosomal peptidesynthesis, NRPS)合成，杆菌素和大环内酯抗生素通过聚酮化合物途径(Polyketide biosynthase, PKS)合成。除表面活性素外，其他基因簇均与模式菌株FZB42具有极高的同源性，相似度均达到100%(表3)。这些基因簇编码合成的物质具有抗病毒、抗细菌、抗真菌和累积铁离子等功能活性。进一步将解淀粉芽胞杆菌BJ-6的表面活性素合成基因簇与FZB42的相关合成基因簇(srfAA-srfAB-srfAC-srfAD)进行全序列比对，相对于FZB42的表面活性素合成基因簇，解淀粉芽胞杆菌BJ-6的表面活性素合成基因序列大量缺失，但是剩余序列仍和FZB42的合成基因簇相关序列高度同源(图2)。

表3 解淀粉芽胞杆菌BJ-6编码的抗菌物质Tab.3 Gene clusters of antibiotic secondary metabolites of B. amyloliquefaciens BJ-6

图2 解淀粉芽胞杆菌BJ-6与模式菌株FZB42的表面活性素合成基因簇比对分析结果Fig.2 Comparison of the surfactin biosynthesis gene clusters between B. amyloliquefaciens BJ-6 and FZB42

2.4 基因转录分析

为了验证抗菌物质合成基因在解淀粉芽胞杆菌BJ-6中是否正常表达，对不同培养时间的解淀粉芽胞杆菌BJ-6总RNA进行提取，并反转录成cDNA，以此为模板，通过设计引物分别扩增抗菌物质合成基因。解淀粉芽胞杆菌BJ-6在NB中培养12～60 h，以不同时间段的cDNA为模板，均扩增到丰原素、杆菌素、大环内酯抗生素、杆菌溶素、儿茶酚型嗜铁素、表面活性素和伊枯草菌素的合成基因目的片段，说明这些抗菌物质合成基因能够正常表达(图3)。

3 讨 论

随着DNA测序技术的革新和基因组学研究的发展，越来越多的芽胞杆菌全基因组被测序，截止目前在NCBI网站公布的芽胞杆菌全基因组有200多个，其中包括枯草芽胞杆菌51株，解淀粉芽胞杆菌18株，这些生物学信息为研究生防芽胞杆菌提供重要的依据。本研究对解淀粉芽胞杆菌BJ-6全基因组进行测序，获得大小为4 175 709 bp的序列，序列的GC含量为46.12%，预测编码区4 075个，加上各种RNA基因共4 261个。与模式解淀粉芽胞杆菌FZB42相比，解淀粉芽胞杆菌BJ-6序列更大，编码蛋白基因数更多。通过KEGG数据库预测到解淀粉芽胞杆菌BJ-6的主要代谢通路共20种，antiSMASH软件预测次级代谢抗菌化合物合成基因簇，发现丰原素、杆菌素、大环内酯抗生素、杆菌溶素、儿茶酚型嗜铁素、表面活性素和伊枯草菌素这7种抗菌化合物的合成基因簇。另外，还发现解淀粉芽胞杆菌BJ-6的表面活性素合成基因簇与模式菌株FZB42的相关合成基因簇序列存在较大差异。对解淀粉芽胞杆菌BJ-6的RNA进行提取并反转录成cDNA，以cDNA模板进行PCR扩增，这7种抗菌物质的关键合成基因都能正常表达。这为下一步鉴定解淀粉芽胞杆菌BJ-6产生的抗菌物质种类奠定基础。