邵铮铮， 周 威， 赵岩岩， 胡梁斌，2， 莫海珍，2， 李红波*，2

（1. 河南科技学院 食品学院，河南 新乡453003；2. 陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安710021）

黄曲霉菌（Aspergillus flavus，AF）作为一类重要的腐生病原真菌，其产生的次生代谢产物黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前已知的最强化学致癌物之一，严重威胁着人类和动物的生命健康[1-2]。 黄曲霉菌广泛存在于粮食及食品中，据AFO 统计全球每年超过30%的粮食作物受到真菌毒素污染， 造成数千亿美元经济损失。 我国是世界上受黄曲霉污染最严重的国家之一[3]。 相关的流行病学研究显示，AFB1 与肝癌发生密切相关，对人类健康造成重大危害[4]。 此外， 黄曲霉能够导致许多门类的动物感染曲霉病，降低或损伤机体的免疫系统，尤其对于免疫缺陷病人感染侵袭性曲霉病往往是致命的[5-6]。 人们一直在寻求对其进行有效防治的策略和技术，包括良好的田间管理、生化防治以及物理化学脱毒方法等[7-9]。但是由于黄曲霉菌污染的发生风险覆盖了从田间原料生产到后期产品消费的整个过程，其控制依旧是亟需解决的世界性难题。 从危害发生过程来看，黄曲霉危害循环经历了从孢子萌发、侵染定植、生长产毒、产孢扩散等过程。 从危害循环上游制定控制黄曲霉菌策略可以更有效的缓解黄曲霉污染的发生。

黄曲霉菌以无性孢子作为主要传播体。 而孢子作为休眠体需要被唤醒萌发后，才能生长发育并进行毒素代谢等次生代谢或者渗透并侵害人体组织导致肺曲霉病发生[10]。 因此黄曲霉孢子萌发可以作为黄曲霉危害发生过程中最上游的生理过程。 孢子萌发第一步就是感知外界环境，进而将信号传递到胞内启动萌发过程[11]。因此，寻找孢子感知环境萌发所依赖的关键因子作为靶标，从最上游阻断黄曲霉孢子萌发，是有效控制黄曲霉污染、开发新型抗菌药物的突破口之一。

作者研究了K+对黄曲霉菌孢子萌发的影响，通过使用K+特异性荧光探针PBFI-AM 研究胞内K+状况。 鉴于K+与黄曲霉孢子萌发相关，进一步研究了特异性电压门控钾离子通道阻滞剂4-氨基吡啶（4-Aminopyridine，4-AP）对孢子萌发的影响。 通过生物信息学预测分析了可能的电压门控钾离子通道蛋白KCNA，并构建KCNA 非洲爪蟾卵母细胞表达体系，使用双电极电压钳系统观察了KCNA 的电生理学特性。 通过确认KCNA 电压门控钾离子通道特性，以期为进一步研究黄曲霉孢子萌发调控机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 黄曲霉孢子悬浮液的制备

菌株为黄曲霉菌CGMCC3.2890，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 PDA 培养基4 ℃保存。取菌株接种于固体沙氏培养基平板上， 放置30 ℃恒温培养箱中静置培养2~3 d， 加入适量体积的0.1%Tritonx-100 于菌板中轻轻晃动使黄曲霉孢子均匀分散于溶液中， 再将孢子液吸取至离心管中，用血球计数板于显微镜下计数，用液体沙氏培养基稀释至所需孢子液浓度，孢子液现用现配。

1.2 KCl 胁迫及4-AP 处理对黄曲霉孢子萌发的影响

在蒸馏水中加入不同浓度的KCl，通过96 孔板培养实验发现，于30 ℃振荡培养，每隔2 小时用显微镜观察拍照，统计孢子萌发率。使用4-AP 阻断钾离子通道活性，观察其对孢子萌发的影响。 使用96孔板，在培养基中加入10 mmol/L 4-AP 处理野生型菌株孢子，于30 ℃振荡培养，每隔2 小时用显微镜观察拍照，统计孢子萌发率。

进一步采用K+荧光探针检测KCl 处理对黄曲霉菌萌发早期胞内K+含量的影响。取黄曲霉孢子悬液（1×105个/mL），添加1 μL PBFI-AM K+荧光探针（体积比1 000∶1），30 ℃、120 r/min 避光摇培孵育60 min，孵育后孢子液于4 ℃放置30 min。之后使用黑色酶标板，每孔添加200 μL 孢子液开始检测，50 s后添加KCl 母液，终浓度分别为0、0.01、0.1、1 mmol/L。该过程中，一直使用多功能酶标仪检测该孔内荧光强度，每5 秒一次，共检测380 次。 激发波长和发射波长为340 nm 和500 nm。 以相对荧光强度（RFU）为纵坐标，时间为横坐标作图。

1.3 钾离子通道蛋白生物信息学分析

借鉴人体电压门控钾离子通道α 亚基（GenBank: AAP46292.1）序列，在黄曲霉菌基因组数据库进行BLAST 检索， 得到其同源蛋白质（XP_002376854.1），将其命名为KCNA。筛选已报道的不同物种电压门控钾离子通道α 亚基蛋白，通过NCBI 数据库查找了各自序列信息， 使用DNAMAN软件进行序列比对分析。 使用TMHMM 软件TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白质进行跨膜预测。 利用http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/网站对KCNA 蛋白质三维结构进行模拟。 利用在线生物信息学网站http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/对其三维结构模型进行综合评价。在zinc 数据库（http://zinc.docking.org/）中下载4-AP（zinc_599985）分子的sdf 文件，利用Autodock 软件进行KCNA 蛋白与4-AP 对接研究[12]。

1.4 KCNA 异源表达及电生理学测定分析

非洲爪蟾卵母细胞处理：取非洲爪蟾冰冻麻醉后，下腹部切口取1cm2左右的卵巢小叶，浸于无Ca2+的OR2 液（82.5 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L Na2HPO4，5 mmol/L HEPES，50 U/mL青霉素，50 μg/mL 链霉素，pH 7.5）的培养皿中。 室温下在含2 g/L 的胶原酶溶液中振荡消化1.5～2 h后，用OR2 液反复冲洗，去除残留于卵母细胞表面的胶原酶。 挑选出外型较圆、色泽清晰、有一定张力、细胞表面光滑、无残留纤维组织及毛细血管的V、VI 期卵母细胞，置于含ND96 液培养皿中。 使用微量注射仪将KCNA 的cRNA 注射到卵母细胞中，每个细胞按2～5 ng/5 nL 注射。

制备cRNA：本研究使用pGEMHE 质粒，引物序列见表1。采用快速克隆技术，连接载体pGEMHE和KCNA 基因片段。 使用DpnⅠ限制性内切酶线性化处理后， 将载体pGEMHE 和KCNA 混合物转化到感受态细胞DH5α 内，最后挑取单克隆进行单酶切及测序鉴定[13]。 使用反转录试剂盒将线性化扩增产物体外转录得到cRNA。

双电极电压钳测定： 注射后的卵母细胞在含2.5 mmol/L 丙酮酸钠的ND96 中20 ℃培养2～3 d后进行电生理学测定。 电极内灌注1 g/dL 琼脂糖、3 mol/L 的KCl，电极电阻＜1 MΩ。 细胞外液成分为ND96， 外源胁迫因子4-AP 使用基础细胞灌流液ND96 调配。 实验在25 ℃进行，数据采集和分析采用pClamp9.0、Clampfit9.0 和Origin9.1 完成。

表1 引物序列表Table 1 Primers list

2 结果与分析

2.1 KCl 胁迫及4-AP 处理对黄曲霉孢子萌发的影响

在蒸馏水中加入不同浓度的KCl，通过96 孔板培养实验发现，低浓度KCl（0.1 mmol/L）胁迫下，随着外界KCl 浓度的增加（0～0.1 mmol/L），黄曲霉孢子萌发率呈现上升趋势，在0.1 mmol/L 达到最高值，见图1。 而随着KCl 浓度的继续增加，黄曲霉孢子萌发率则呈现下降趋势，高浓度的KCl 胁迫（1～50mmol/L）显著抑制孢子萌发。

图1 不同浓度KCl 对黄曲霉孢子萌发的影响Fig. 1 Effect of KCl on spore germination of A.flavus

进一步采用K+荧光探针检测KCl 处理对黄曲霉菌萌发早期胞内游离K+浓度的影响。 结果见图2。0.1 mmol/L KCl 处理后， 胞内游离钾离子浓度迅速升高，与图1 孢子萌发数据相吻合，可见适合孢子萌发的特定浓度K+能够激发黄曲霉孢子产生瞬间的高钾离子流，K+响应为黄曲霉孢子萌发的早期信号。

图2 不同浓度KCl 诱导黄曲霉孢子内钾离子的改变Fig. 2 Changes of K + was induced by different KCl concentrations in spores of A. flavus

4-AP 是一种特异性电压门控钾离子通道阻断剂，我们初步使用4-AP 阻断钾离子通道活性，观察其对孢子萌发的影响。 使用96 孔板，在培养基中加入10 mmol/L 4-AP 处理野生型菌株孢子， 于30 ℃振荡培养，每隔2 小时用显微镜观察拍照，统计孢子萌发率。结果发现10 mmol/L 4-AP 处理能够明显抑制并延迟孢子的萌发，见图3。

图3 4-AP 处理对黄曲霉孢子萌发的影响Fig. 3 Effect of 4-AP treatment on the spore germination of A.flavus

2.2 钾离子通道蛋白KCNA 预测及建模

筛选已报道的不同物种电压门控钾离子通道α亚基蛋白，通过NCBI 数据库查找了各自序列信息，使用DNAMAN 软件进行序列比对分析。 结果发现，黄曲霉菌KCNA 的423-FAFCSLLTIGYGDITPTT-440 区序列与智人、秀丽隐杆线虫、原鸡等电压门控钾离子通道α 亚基蛋白孔区片段同源性较高，都拥有保守的TxGYGD 钾离子选择器特征片段，见图4（a）。 红色框表示在序列中一样的氨基酸残基。主要物种信息如下：Hsap = [智人，Homo sapiens，(AAP46292.1)]；Ppen=[Polyorchis penicillatus，(AAB39750.1)]；Cele = [秀丽隐 杆 线 虫，Caenorhabditis elegans，(AAB95119.1)]；Ggal = [原鸡，Gallus gallus，(AAP94023.1)]。

使用TMHMM 软件对KCNA 蛋白进行跨膜预测，发现其有明显的6 个跨膜区域，见图4（b）。同时胞内还有较短的N 端和较长的C 端，符合典型的钾离子通道蛋白特性。 利用http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/网站对KCNA 蛋白三维结构进行模拟，KCNA 三维结构模拟图见图4（d）。利用在线生物信息学网站 http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/对其三维结构模型进行综合评价。三维结构模型综合评价Ramachandran plot 分析发现，KCNA三维结构97.8%Φ-Ψ 二面角分布在允许区域， 见图4（c）。不允许范围的比例非常小，说明三维结构中氨基酸的二面角是合理的。 证明模拟的KCNA 三维结构合理，可以用于下一步分子对接。

在zinc 数据库（http://zinc.docking.org/）中下载4-AP（zinc_599985）分子的sdf 文件，利用Autodock软件进行KCNA 蛋白与4-AP 对接研究， 对接结果见图4（e）。 4-AP 可作用于KCNA 钾离子选择器区域附近， 与403 位半胱氨酸、419 位谷氨酰胺、468位苏氨酸以氢键方式结合， 这与4-Ap 可以抑制孢子萌发的数据相吻合，进一步支持了KCNA 作为电压门控钾离子通道的可能性。

2.3 KCNA 电生理学测定

将KCNA 克隆到质粒载体pGEMHE 中， 成功构建蛙卵细胞表达体系。将细胞置于ND96 溶液中，细胞膜电位钳制在-40 mV，去极化至+60 mV，阶幅为20 mV，刺激时间为500 ms。实验发现，有一个持续的外向电流出现，并随去极化程度增加而增大， 见图5。当从钳制电位-40 mV 去极化至+60 mV 时，可记录到最大幅度的外向电流。 钾离子通道抑制剂4-AP对该外向电流有明显的抑制作用，使用10 mmol/L 4-AP处理可以显著的阻断KCNA 电流，结果进一步证实了KCNA 电压门控钾离子通道蛋白属性。 前述4-AP 能够抑制黄曲霉孢子萌发， 可见钾离子通道蛋白与孢子萌发密切相关。

图4 钾离子通道KCNA 生物信息学分析Fig. 4 Bioinformatics analysis of potassium channel KCNA

图5 钾离子通道阻滞剂4-AP 阻断KCNA 外向电流Fig. 5 4-AP（potassium ion channel blocker）blocking the KCNA outward current

3 结 语

本研究发现，一定浓度的胞外KCl 能够影响黄曲霉孢子的萌发。 通过使用K+特异性荧光探针PBFI-AM，发现适合孢子萌发的特定浓度K+能够激发黄曲霉孢子瞬间产生较高的钾离子流，说明K+响应可能是黄曲霉孢子萌发的早期信号。 4-AP 作为特异性电压门控钾离子通道阻滞剂，能够明显抑制并延迟孢子的萌发。 这些结果表明，电压门控钾离子通道可能参与黄曲霉孢子萌发。 借鉴人体电压门控钾离子通道α 亚基序列，在黄曲霉菌基因组数据库进行BLAST 检索，得到其同源蛋白KCNA。 通过对KCNA 进行序列分析，发现其423-FAFCSLLTIG YGDITPTT-440 区序列与智人、秀丽隐杆线虫、原鸡等电压门控钾离子通道α 亚基蛋白钾离子选择器区域序列同源性较高，拥有明显的钾离子选择器特征。利用Autodock 软件进行KCNA 与离子通道阻断剂4-AP 的对接研究， 对接结果支持了KCNA 作为电压门控钾离子通道α 亚基的可能性。研究证实4-AP 可以抑制孢子萌发， 这说明钾离子通道在黄曲霉孢子萌发中起到重要作用。 通过构建KCNA 非洲爪蟾卵母细胞表达体系，用双电极电压钳系统测得KCNA 外向型电流， 一定程度上证明了其电压门控钾离子通道蛋白属性。

细胞内K+稳态是多数生物代谢机制和综合性能优化运行的先决条件，胞内K+动态平衡由细胞质和细胞膜上的许多K+通道和转运蛋白所调控[14]。 在孢子萌发早期阶段，膜通透性增加，导致孢子内离子和水重新分配，孢子内80%的K+快速释放到孢子外，随后K+依赖能量被再次吸收[15]。 而离子的移动往往涉及到离子通道的响应，这也是细胞识别外界信号的一个重要途径。 阻断离子通道能够抑制外源信号的细胞内传导，研究发现使用钾离子通道抑制剂四乙胺能够完全抑制花粉或无性孢子的萌发[16]。电压门控钾离子通道是目前存在最广泛且最复杂的一大类钾离子通道， 是药物设计的重要靶标之一。 Gobert 等通过敲除和过表达拟南芥中钾离子通道TPK1， 发现TPK1 对保持胞内K+动态平衡起着重要作用，能够影响种子的萌发、生长和气孔运动[17]。敲除拟南芥花粉管K+通道AKT6 后，花粉管萌发率与野生型相比大幅度降低， 并且AKT6 对外界pH变化非常敏感[18]。 然而关于真菌电压门控钾离子通道的相关文献较少，黄曲霉孢子萌发过程中是否涉及到电压门控钾离子通道更是尚无研究报道。 本研究为从根源上防控黄曲霉菌污染，寻找抗性靶标提供了一个新思路。