罗建 范新荣 叶强 魏燕 李新 刘应才

心房颤动(简称房颤)是临床上最常见的一种心律失常.既往已有部分实验研究证实房颤发病机制与心房肌基因及蛋白表达异常相关.大力水手结构域(Popdc)是新发现的蛋白家族(Popdc1、2、3),由包含三个跨膜域膜蛋白的基因编码,蛋白质的羧基末端部分定位于细胞质,包含一个高度保守序列的蛋白质域.Popdc内包含环磷酸腺苷(c AMP)高亲和力的结合位点,在c AMP的介导下,Popdc蛋白与钾通道TREKG1相互作用,增加细胞表面的钾通道的通透性,增加外向电流强度,从而引发快速型心律失常[1].Popdc1、2、3在心脏和骨骼肌都有丰富表达[2],其中Popdc1和Popdc2在心脏传导系统中包括窦房结和房室结有高水平的表达[3].既往GWAS研究发现Popdc1基因与房颤的发病相关[4],并认为Popdc在小鼠骨骼和心肌受应激或压力时发挥重要作用.Popdc1或Popdc2敲除小鼠动物受到应激时,会出现严重的窦房结功能紊乱及房性心律失常,并且心律失常发生与年龄增长呈正相关[5].Popdc1还在终末期心力衰竭患者的心脏中表达量下降[6],且对小鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用[7].但Popdc亚型的表达是否与房颤的发生及维持相关,且与房颤患者的相关因素的相关关系仍未研究清楚,本实验采用外科心脏手术病人的右心耳为研究对象,验证Popdc亚型在人心耳中的表达,同时结合病人的年龄、性别、纽约心功能分级、基础疾病等临床数据,分析Popdc表达变化与房颤的相关性.

1 资料与方法

1．1 资料来源 选取2018年6月至2018年12月在本院行心脏外科手术患者34例(瓣膜置换术32例、心房粘液瘤切除术1例、房间隔修补术1例),分为窦律组14例和房颤组20例.根据心电图记录,房颤定义为P波消失,代之f波,心房率350~600次/分,QRS波节律绝对不规则,表现为RR间期不匀齐,QRS波形态多正常.诊断标准依据«心房颤动:目前的认识和治疗的建议G 2018»[8].排除标准:①有感染性心内膜炎;②临床上有风湿性活动征象;③患者及家属不同意者.用无菌、无RNA酶的1．5 ml Eppendorf管快速收集进行开胸心脏手术患者的右心耳组织50~100 mg,用于IHC染色和Massom染色的标本用4%多聚甲醛固定液固定;用于 Western blot和qPCR的组织标本立即在液态氮冷冻和储存在－80℃.人体组织采集方案经本院伦理委员会批准并获得患者家属的书面知情同意.在实验分析结束以前,所有标本的病人的信息是匿名编码的,实验结束之后公开,病人的特征见表1.

表1 两组间临床资料的比较

1．2 超声心动图 所有患者术前常规行超声心动图检查,采用Philips iE33超声系统(Andover,Md．,USA),1~5 MHz换能器,根据中国成年人超声心动图检查测量指南[9],患者行左侧位检查.采集指标:LAD、RVD、LVESD、LVEDD、RAD、LVEF,LVEF＝(LVEDDGLVESD)/LVEDD×100%.

1．3 IHC染色和Masson染色 将心耳组织从4%多聚甲醛固定液中取出,用组织脱水机(Leica,德国)、组织包埋机(Leica,德国)和组织切片机(Leica,德国)完成不同浓度的酒精脱水和石蜡包埋、切片.然后行Masson染色和IHC染色,免疫组化的抗体分别为兔多克隆抗体识别的Popdc1(1/500稀释,Affinity,中国,常州)、小鼠多克隆抗体识别的PopG dc2(1/1 000稀释,Abcam,中国,上海)、兔多克隆抗体识别的Popdc3(1/1 000稀释,Abcam,中国,上海).通过Case Viewer平台观察结果.用IPP6．0分析免疫组化和Masson染色结果.

1．4 免疫印迹试验 将存储在－80℃冰箱的心耳样本用液氮研磨成粉末状,然后提取到高强度的RIPA蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制剂)中,14 000 g离心15 min,取上清液,用BCA法测定蛋白浓度.将提取的样本蛋白在99°C变性7 min.变性的蛋白用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)分离,然后转移到聚偏二氟乙烯上(ImmunGBlotPVDF膜;BioGRad,Hercules,CA,USA).在室温下,用含有5%脱脂牛奶的吐温G20(TBST)缓冲盐水封闭膜1 h.膜分别用兔多克隆抗体识别的Popdc1(1/500稀释,Affinity,中国,常州)、小鼠多克隆抗体识别的Popdc2(1/1 000稀释,Abcam,中国,上海)、兔多克隆抗体识别的Popdc3(1/1 000稀释,Abcam,中国,上海)和GAPDH(1/4000稀释,Beyotime,中国,上海)在4°C孵育过夜(大约14 h).在TBST洗涤后,膜放在相应的二抗中室温下结合1 h.在TBST中再次洗涤印迹,使用化学发光液(advansta,美国,门洛帕克市)检测条带,使用 Quantity One software version 4．2．6(BioG Rad)进行定量.免疫印迹实验至少重复3次.GAPDH蛋白作为内参蛋白.计算检测到的PopG dc1蛋白条带相对于同一个体GAPDH条带的平均归一化光密度(OD),并进行统计分析.

1．5 定量聚合酶链反应 基因表达用TB Green realGtime qGPCR(CFXGconnect RealGTime PCR DeG tection System,BioGRad)进行实时PCR验证.用液氮将冷冻组织样本研磨成粉末状,用Trizol试剂(15596018,Invitrogen)从粉末中提取组织总RNA,经氯仿提取、异丙醇沉淀、去DNA杂质处理、聚丙烯酰胺凝胶电泳质控.用分光光度计测定RNA浓度和纯度.RNA溶液被储存在－80℃直至使用时.抽取2μg的总RNA,然后用(RR047B,Takara)逆转录.Popdc1、Popdc2、Popdc3和GAPDH序列由擎科生物(中国,成都)提供.Popdc1(F:5′“G TCTCCCTTCCCTCTTTCCG3′;R:5′GCACAGG CATCCTACCATTCCG3′)Popdc2(F:5′“GAGGAGG CAGGCATTGGTAGG3′;R:5′GCCCTGTGGTG GGGTTTG3′)和 Popdc3(F:5′“GTGCCTTGAATG GACAGGGTG3′;R:5′GAGGGGTGATCTGCGG TATTTG3′),GAPDH(F:5′GGGGGCTCTCG CAGAACATCG3′);R:5′GTGACACGTTGG GCAGTGGG3”).qPCR反应混合物包含包含10μl TB Green Premix Ex TaqⅡ2×(Tli RNase H Plus,Takara,Japan),2μl cDNA,0．4μl ROX Reference Dye II(50×),0．8μl 10 umol/L上游引物和0．8μl 10 umol/L下游引物,6μl无RNA酶的灭菌用水,最后混合成一个20μl的体系.qPCR循环程序分为两步.第一步为95℃,持续30 s,第二步为95℃反复循环45次,变性时间为5 s,退火温度为60℃,持续30 s.通过监测熔融温度曲线和琼脂糖凝胶电泳试验,优化了qPCR反应条件.使用Mastercycler Ep Realplex软件2．0版(Eppendorf,Hamburg,Germany),将每个样本的阈值循环(CT)值与各自标准曲线的CT值进行比较,计算出目标cDNA的起始量.靶基因表达水平归一化为GAPDH转录水平.

1．6 统计分析 数据用平均数±标准差表示.n代表样本例数.采用配对和/或非配对的T检验来评估两组均值差异的统计学意义.采用线性回归的方法对蛋白或m RNA的含量与年龄、性别、RHD的相关性进行分析.P＜0．05为有统计学意义.数据分析采用SigmaPlot12．5,USA分析.作图采用GraphPad Prism 8,USA.

2 结果

2．1 两组病例资料的比较 与窦律组比较,房颤组女性多、风心病多、LA增大、LVEF下降,差异有显著性(P均＜0．05或0．01),见表1.

2．2 两组右心耳组织纤维化程度(Masson染色)的比段 蓝染的胶原纤维在两组患者的右心耳肌束间均可看到,见图1.包裹着心肌组织的胶原纤维在房颤组比窦律组增生显著(0．66±0．09 vs 0．40±0．05,P＝0．0002).

图1 两组Masson染色切片的对比

2．3 两组免疫组化(IHC)染色的比较 Popdc1、Popdc2、Popdc3均表达于心肌细胞之间的连接中,包括横管、纵管和闰盘.房颤组Popdc1、Popdc3在右心耳中的表达都明显强于窦律组,分别为0．06±0．01 vs 0．04±0．01,0．06±0．01vs0．05±0．01,P均＜0．05;而Popdc2在两组间的表达无明显差异,0．06±0．002 vs 0．07±0．02,P＞0．05.见图2.

2．4 两组Popdc蛋白的比较 房颤组Popdc1、Popdc3在右心耳中的表达亦都明显强于窦律组,分别为1．44±0．51 vs 1．08±0．33、1．75±0．70 vs 1．06±0．11,P均 ＜0．05;而Popdc2在两组间的表达无明显差异,1．49±0．55 vs 1．21±0．53,P＞0．05.见图3.

图2 两组Popdc1－3免疫组化染色切片比较

图3 两组Popdc1－3蛋白表达量的电泳比较

2．5 两组Popdc mRNA的表达 房颤组Popdc1、Popdc3在右心耳中的表达也都明显强于窦律组,分别 为1．34±0．65 vs 1．07±0．42、1．23±0．40 vs 1．03±0．26,P＜0．05;而Popdc2的房颤组与窦性组之间表达无明显差异,1．05±0．49 vs 1．08±0．37,P＞0．05.

2．6 Popdc与房颤等其他因素的相关性 房颤与Popdc1和Popdc3的蛋白和m RNA表达均成正相关,但与Popdc2的表达无相关性,见表2.除房颤组Popdc2 m RNA的表达与性别相关以外,其余Popdc的表达与年龄、性别或NYHA无相关性,见表3.

表2 Popdc与房颤的相关性

3 讨论

3．1 本研究发现 本研究发现风心病增加了房颤的发病风险,女性可能比男性更容易患风湿病,从而更多发生房颤.房颤可导致房室肥厚,左房增大,LVEDD、LVEF降低,这也符合房颤的病理生理变化[10].同时,房颤患者的心肌纤维化较窦性患者明显增加,提示心肌结构重构可能会影响Popdc表达水平.慢性房颤患者Popdc1和Popdc3免疫组化染色增加,Popdc2的表达无明显异常.且蛋白表达水平、m RNA水平提示相同的变化趋势.

3．2 与既往结果比较 在免疫荧光染色下,发现Popdc1和Popdc2存在于小鼠心肌细胞之间的连接中[3],这与本研究观察到的结果相同.Tan等[4]报道Popdc1与心律失常相关,并且与房颤相关,但具体关系未阐明,本研究发现房颤患者的Popdc1和Popdc3表达增强.然而,本研究没有发现房颤组和窦律组患者在Popdc2水平上的差异.可能的解释为人类基因组中,Popdc1和Popdc3在人类染色体6q21上呈串联排列基因,而Popdc2定位于人类染色体3q13．33[1],亚基1、3与亚基2在不同的染色体上.从而调控Popdc1、3亚基的表达与Popdc2亚基表达出现分离的现象.另外有研究证实,斑马鱼中Popdc2的缺失会导致心律失常,包括窦性心动过缓,房室传导阻滞,窦房阻滞[5].当Popdc1或Popdc2缺陷小鼠动物受到物理或者精神应激时,会出现严重的窦房结功能紊乱及心房心律失常发生,并且与年龄有关[3].所以笔者推测Popdc1与PopG dc3与房颤等房性心律失常明显相关,而Popdc1与Popdc2与缓慢性心律失常发生机制相关.有研究表明在慢性终末期心力衰竭病人的心肌组织中,Popdc1的表达下调[6].考虑心衰患者多合并有房颤,房颤患者晚期多进展为心力衰竭,房颤和心力衰竭有许多共同的发病机制,这与本研究的结果改变不一致.笔者认为可能是早期代偿效应,且本研究选取的患者均不是终末期心衰患者,且心房与心室肌细胞表达存在差异,但具体的机制需进一步的基础实验验证.

表3 Popdc与其他因素的相关性

3．3 心脏不同部位Popdc表达的差异 在本研究中,我们收集了右心耳作为代表.房颤的触发和维持主要发生在左心房,但右心耳比左心耳更易取样,且左右心耳基因表达具有一致性[11－13].由于大多数关于人体组织的研究仅限于右房的[14],因此在临床上收集左右心耳是很困难的.因此认为右心耳组织可代表整个心房的病理变化,可作为研究材料阐明房颤的发病机制.

3．4 Popdc的重塑与疾病等因素的关系 本研究发现房颤与性别、风心病、LAD、LVEDD等临床参数存在明显的正相关关系.值得注意的是,越来越多的女性罹患房颤[15].进一步研究表明年龄、性别和风心病、心功能分级对Popdc蛋白和基因的表达无显著影响.房颤的发病率和患病率随着年龄的增长而增加.随着年龄的增长,心房离子通道的结构和功能的改变为房颤发生及维持提供了结构基质[16].但本研究没有发现年龄变化对Popdc的表达有显著影响,可能是样本例数较少的限制.

3．5 研究的局限性 由于取材的限制,本研究的样本量较小,目前的研究数据不能推广及所有房颤患者.此外,药物可能会影响离子通道蛋白和基因的表达.我们的结论发现房颤与Popdc蛋白的上调有关.然而,启动Popdc通道重构的具体因素尚不清楚.可能与房颤中能量代谢异常、离子通道重构及Popdc与钾离子通道脱偶联等机制相关,尚需进一步基础研究验证其致病机制.