叶艮英，梁淑贞，何瑞荣，何淑芬，丁少波

(东莞市人民医院药学部，广东 东莞 523059)

随着我国老龄化进程加快，老年人多存在多种疾病共存、用药复杂、用药量大以及药动学和药代学改变，用药不合理是导致患者治疗时或预后发生不良反应的主要原因之一[1]。而细胞色素P450酶系作为肝脏微粒体混合功能酶系统最重要的药物代谢酶，与多种药物的代谢失活增效密切联系[2]。近年来本院收治的冠心病患者显著增加，其中以急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)为主，笔者通过观察发现在给与经皮冠状动脉介入治疗(percultaneous coronary interbention，PCI)治疗后给予氯吡格雷等双联抗血小板方案用于减少术后血栓事件的概率，但小部分患者仍出现缺血事件而再次入院，笔者分析认为可能原因为氯吡格雷抵抗，其发生原因与患者代谢相关酶突变有关，但各地区、种族基因突变大有不同[3-4]，文献中未见有东莞地区的CYP2C19基因多态性研究，故笔者通过研究东莞地区老年汉族ACS患者CYP2C19基因多态性研究及对患者预后影响，为临床汉族ACS患者个体化用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月-2017年1月东莞市人民医院收治老年汉族ACS患者578例作为观察对象，所有观察对象均符合中华医学会心血管病学分会《非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南》关于ACS相关诊断标准[5]。纳入标准：(1)年龄65～85岁；(2)入组前1个月内未使用其他抗血小板、抗凝药物及PPIs者；(3) 依从性好，可以按计划坚持服药、且配合研究定期随访者；(4)无神经精神疾病、有能力充分知情理解研究内容。排除标准：(1)患有严重血液系统疾病或有出血倾向；(2)严重感染；(3)有氯吡格雷或阿司匹林禁忌证；(4)严重肝肾功能不全；(5)恶性肿瘤患者；(6)妊娠期、哺乳期妇女。采用焦磷酸测序技术检测入组患者CYP2C19基因型，并根据不同的代谢型分组。本研究经本院医学伦理委员会审批。

1.2 CYP2C19基因检测方法

1.2.1 主要仪器与试剂 焦磷酸测序仪Q24 MDx(德国凯杰公司)；5810R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；ETC811型PCR仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)。全血基因组DNA提取试剂盒(长沙三济生物科技有限公司)；激活剂F(Haemoscope公司)；ADP(规格：2 μmol/L，Haemoscope公司)；AA(规格：1 μmol/L， Haemoscope公司)。

1.2.2 基因组提取 患者入组当日或次日以EDTA采血管采集静脉血5 mL，24 h内送东莞市人民医院PCR实验室，血样采集后于4 h内完成DNA提取[6]。吸取全血250 μL于1.5 mL EP管中，采用全血基因组 DNA 提取试剂盒提取 DNA按照试剂说明书操作[7]。提取结束后加入预热到 65 ℃的洗出液 50 μL 洗脱液或dd H2O洗脱，-20 ℃保存待用。

1.2.3 PCR扩增、反应分析 用在线NCBI和 PyroMark Assay Design 2.0 软件共同设计用于CYP2C19不同基因型上下游引物，用PrimerSTAT 高保真酶进行PCR扩增[8]，将PCR产物进行测序按照试剂及仪器说明使用焦磷酸测序仪检测CYP2C19基因型。

1.2.4 基因型和代谢表型判定CYP2C19*1位于第636位和第681位均为发生突变则为野生型，CYP2C19*2位于681位碱基G→A，CYP2C19*3位于636位碱基G→A。其中636GG,681GG即*1/*1为广泛代谢型；636GG,681GA即*1/*2和636GA,681GG即*1/*3为中间代谢型；而636GG，681AA即*2/*2、636GA，681GA即 *2/*3和636AA，681GG 即*3/*3共为弱代谢型。

1.3 随访及相关数据收集

收集所有观察对象的性别、病史、吸烟史、糖尿病史、高血压史等一般临床资料，随访期为12个月，出院后1个月、3个月、6个月及12个月定期随访，随访方式有门诊复诊、再住院或电话随访，收集随访期间发生的心血管不良事件[9]，并根据患者CYP2C19基因的代谢型不同进行分组分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 东莞市老年汉族人群CYP2C19相关等位基因频率分布

本研究纳入样品共578例，CYP2C19*1,*2,*3基因频率分别是62.63%,30.11%和7.27%，其中不同性别中的各等位基因评率如表1所示，不同性别中，CYP2C19*1,*2,*3基因频率比较差异无统计学意义(χ2=1.177，P=0.555)。

2.2 东莞市老年汉族ACS患者CYP2C19相关基因型及代谢型分布

东莞市老年汉族ACS患者CYP2C19相关基因型频率为*1/*1占227例(39.28%)、*1/*2占224例(38.76%)、*1/*3占46例(7.96%)、*2/*2占49例(8.48%)、*2/*3占26例(4.50%)、*3/*3占6例(1.04%)，如表3所示，符合Hardy-Weinberg 遗传平衡检验(χ2=1.484，P=0.953)，本研究所选研究对象具有群体代表性，处于平衡状态，如表2所示。

东莞市老年汉族ACS患者CYP2C19相关代谢型频率为广泛代谢型占227例(39.28%)、中间代谢型占27例(46.72%)、弱代谢型占81例(14.02%)，如表4所示。

2.3 不同CYP2C19等位基因代谢型的ACS患者预后比较

不同代谢型的ACS患者临床一般资料比较如表5所示，3组患者性别比例、年龄、冠心病史、糖尿病、高血压等项目比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3种代谢型ACS患者除血管性死亡例数差异无统计学意义(P>0.05)外，随访期间发生脑梗死、心绞痛复发入院、轻度出血、血小板减少、再次靶血管重建等心血管不良事件发生率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，如表6所示。

随访期间，共有59例患者发生临床终点事件，其中急性脑梗死23例，急性心肌梗死31例，血管性死亡5例；其中广泛代谢型、中间代谢型和弱代谢型发生率分别为10.17%(6例)、35.60%(21例)、54.24%(32例)，不同组别间临床终点事件发生率比较，差异具有统计学意义(χ2= 46.67 ，P=0.000)。

表1 东莞市老年汉族人群CYP2C19相关等位基因频率Table 1 Frequency of CYP2C19 related alleles in the elderly Han population in Dongguan [n(%)]

表2 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验Table 2 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test

表3 东莞市老年汉族ACS患者CYP2C19相关基因型分布Table 3 Distribution of CYP2C19-related genotypes in elderly Han ACS patients in Dongguan [n(%)]

表4 东莞市老年汉族ACS患者CYP2C19相关代谢型分布Table 4 Distribution of CYP2C19-related metabotypes in elderly Han ACS patients in Dongguan [n(%)]

表5 3种代谢型ACS患者基线资料比较

Table 5 Comparison of baseline data for three metabolic ACS patients

广泛代谢型(n=227)中间代谢型(n=270)弱代谢型(n=81)P值性别(男/女,n)133/94151/11950/310.993年龄/a( x±s)65.47±11.2364.11±10.8265.07±9.180.362冠心病史/a( x±s)10.23±5.1011.36±4.2911.00±5.720.070糖尿病[n(%)] 46(20.27)71(26.30) 23(28.40)0.641高脂血症[n(%)] 146(64.32)163(60.37) 50(61.73)0.996高血压[n(%)] 187(82.38)240(88.89) 73(90.13)0.972吸烟[n(%)] 37(16.30)53(19.63) 14(17.29)0.955

表6 3种代谢型ACS患者随访期间心血管不良事件比较

Table 6 Comparison of cardiovascular adverse events during follow-up of three metabolic ACS patients [n(%)]

广泛代谢型(n=227)中间代谢型(n=270)弱代谢型(n=81)P值脑梗死3(1.33)11(4.07)9(11.11)0.001 3心绞痛复发39(17.18)67(24.81)40(49.38)0.000 2轻度出血35(15.42)18(6.67)2(2.47)0.001 2血管性死亡1(0.44)3(1.11)2(2.47)0.308 7血小板减少23(10.14)6(2.23)0(0)0.000 1再次靶血管重建0(0)3(1.11)7(8.64)0.000 0

3 讨论

随着药物代谢动力学与基因细胞组学的高度发展，研究药物代谢差异与基因多态性相关成为近年来的研究热点[10]。另一方面心血管疾病已经成为威胁我国老龄人口的重要疾病，ACS是导致患者急性猝死的主要类型[11]。PCI术联合术后药物预防血栓治疗是ACS患者常用治疗方式，大量研究发现CYP2C19*1位正常编码酶活性的等位基因，而*2、*3等位基因的突变可减弱氯吡格雷抑制血小板活性[12]。但CYP2C19酶相关基因在不同人种中差异明显，具有基因多样性[13]，且未见有东莞地区汉族老年人群CYP2C19基因多态性的相关研究，而我院心内科收治的患者主要类型为ACS，故针对ACS患者，采用焦磷酸测序检测患者CYP2C19基因型，为临床接受氯吡格雷患者的个体化用药提供依据。

本研究中，东莞地区汉族老年ACS患者 578例中，CYP2C19*1,*2,*3基因频率分别是62.63%,30.11%和7.27%，CYP2C19相关基因型频率为*1/*1占39.28%、*1/*2占38.76%、*1/*3占7.96%、*2/*2占8.48%、*2/*3占4.50%、*3/*3占1.04%，而CYP2C19相关代谢型频率为广泛代谢型占39.28%、中间代谢型占46.72%、弱代谢型占14.02%，主要集中于快代谢型和中间代谢型为主，而肖旋浩等[14]研究的广州地区汉族人群CYP2C19基因多态性结果显示主要为中间代谢型，李洁等[15]研究安徽地区的结果以及范超等[16]研究的重庆地区的结果相似。CYP2C19是细胞色素P450中重要的亚型之一，在多种药物体内代谢中起着重要作用。研究发现，CYP2C19还可通过抑制白细胞活化黏附、抑制血小板功能和减少细胞黏附因子分泌等影响多种生理活动[17]。而CYP2C19的编码基因位于第10号染色体上，其中位于外显子5 上 681位碱基CYP2C19*2和外显子4上的636位碱基CYP2C19*3突变是影响药物代谢的重要遗传因素[18]。当CYP2C19*1突变为CYP2C19*2时，产生一个无功能蛋白，当突变为CYP2C19*3时，产生功能较低的CYP2C19酶，当含有1个或2个突变基因时，可导致CYP2C19酶活性较CYP2C19*1*1基因型降低[19]。

氯吡格雷作为临床常用的血小板抑制剂，临床上常与阿司匹林联用，用于缺血性脑卒中、急性心梗以及PCI术后置入支架患者术后血栓复发的预防方案[20]，其主要作用机制为选择性抑制二磷酸酰苷与血小板受体结合，进而抑制尤其诱发的糖蛋白GPIIb/IIIa复合物的作用，最终达到抑制血小板抑制的目的[21]。在体外氯吡格雷并无抗血小板作用，口服吸收后可在CYP2C19的作用下氧化水解成活性代谢物，发挥药效[22]。本研究中弱代谢型患者也占14.02%，而在不同CYP2C19等位基因代谢型的ACS患者预后比较中，3种代谢型ACS患者除血管性死亡例数差异无统计学意义外，脑梗死、心绞痛复发入院、轻度出血、血小板减少、再次靶血管重建等心血管不良事件发生率比较差异明显。其中广泛代谢型患者的轻度出血和血小板减少高于中间代谢型和弱代谢型，说明针对广泛代谢型患者应稍减少药物用量，以减少该类药物引起牙龈出血、血小板减少等不良反应。而在脑梗死、心绞痛复发、再次靶血管重建中，弱代谢型患者发生率明显高于广泛代谢型和中间代谢型，张鹏博等分析发现携带了一个CYP2C19突变型基因的患者，可出现氯吡格雷活性产物转化率下降，因此导致用药后血药浓度不足，而增加ACS患者预后由于血小板抑制功能不足，增加不良心血管疾病发生风险[23]，且在随访期间，共有59例患者发生临床终点事件，其中急性脑梗死23例，急性心肌梗死31例，血管性死亡5例；其中广泛代谢型、中间代谢型和弱代谢型发生率分别为10.17%、35.60%、54.24%，说明由于基因突变导致的不良心血管事件可危及患者生命，因此，研究老年汉族ACS的CYP2C19基因多态性，并以此指导临床用药，尽量避免不合理用药具有重要意义。

综上所述，东莞市老年汉族ACS患者中，主要以中间代谢型为主，不同基因亚型的患者预后有所不同，临床应根据不同CYP2C19基因型给予患者不同的治疗方案，减少患者心血管不良事件发生风险。