王蕾 王心晓 陈忠仁 沈彬 欧宗兴

中南大学湘雅医学院附属海口医院呼吸内科570208

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常见的组织类型,约占所有肺癌患者的80%～85%,该病的发病率和病死率均位居前列[1]。近年来,尽管NSCLC的临床诊治方法已得到不断提高与更新,但患者的整体预后仍不理想,5年生存率一直较低[2]。NSCLC的发生、发展是一个多因素共同参与的复杂性生物学过程[3],目前尚不清楚确切的发病机制,因此,探究NSCLC的分子生物学特点及发病机制,对于提高NSCLC的临床诊治疗效具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200核苷酸的不编码蛋白质的RNA[4]。近几十年的研究发现,lnc RNA可在表观遗传学、基因组转录水平及转录后水平等多个层面上调控基因的表达[5-6],同时,lnc RNA也与包括癌症在内的多种疾病的发生有关[7-8]。本研究重点分析了一种新 的lncRNA,即 位 于20p11的lncRNA linc00261[9],尽管有研究表明lncRNA linc00261在多种癌症进展中发挥作用[10-11],但lncRNA linc00261在NSCLC中的作用如何尚未被发现。因此,本研究初步探讨了lncRNA linc00261在NSCLC组织中的表达及其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究纳入中南大学湘雅医学院附属海口医院2017年2月至2018年9月收治的100例NSCLC患者,其中男59例,女41例;年龄(61.35±11.07)岁,年龄范围为42～79岁。本研究符合 《赫尔辛基宣言》的原则,患者及其家属均签署临床研究知情同意书。所有患者均接受手术治疗,经手术病理确诊为原发性NSCLC,术前均未接受任何放疗、化疗等辅助治疗,同时术中取对应癌旁组织(距癌组织边缘≥1 cm)为对照组织,所有癌旁组织样本均经病理证实为正常肺组织。所有经手术取出的新鲜NSCLC组织及癌旁组织均立即经液氮冷冻处理,并于-80℃的冰箱中保存待用。

NSCLC细胞系A549细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃、5% CO2常规培养,每2 d换液1次。

1.2 方法

1.2.1 实时定量反转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测NSCLC组织及癌旁组织中lncRNA linc00261的表达 取50 mg左右样本组织超声匀浆,严格按RNA提取试剂盒(美国GeneCopoeia公司)说明书提取组织中总RNA,使用紫外分光光度计(美国赛默飞公司)测定RNA质量和浓度。严格按逆转录试剂盒(美国ABI公司)操作说明书进行逆转录反应,反应体系为20μl,冰上依次加入以下试剂:1μmol/L逆转录特异性引物3μl、10×RT buffer 1.5μl、100 mmol/L d NTPs 0.15μl、50 U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0μl、20 U/μl RNA酶 抑 制 剂0.19μl、总RNA 1μl,加DEPC水补至20μl。反应条件:25℃反应10 min,37℃反应60 min,85℃反应5 min,产物4℃保存。按照STBR Premix Ex Taq试剂盒(大连宝生物有限公司)操作说明书进行qPCR扩增。反应体系为20μl,冰上依次加入以下试剂:逆转录产物cDNA 1μl、引物1μl、Taq Man GEx MASTER Mix 10μl,加双蒸水补至20μl。反应条件:95℃反应5 min预变性,95℃反应15 s,56℃反应30 s,72℃反 应30 s,共40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算lncRNA linc00261表达水平,以GAPDH为内参,计算3个复孔均值,根据各样本的平均Ct值,以2-ΔΔCt表示目的基因表达水平,lncRNA linc00261相对表达 量=2-ΔΔCt值(lnc RNA linc00261)-2-ΔΔCt值(GAPDH)。

1.2.2 lnc RNA linc00261表达质粒的构建、转染及鉴定 根据GenBank中lncRNA linc00261基因序列,由大连宝生物有限公司合成lncRNA linc00261表达质粒。严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒(上海书吉生物科技有限公司)操作说明书将lncRNA linc00261表达质粒及空载体转染至A549细胞,转染48 h后,收集细胞,采用qRT-PCR检测重组质粒在A549细胞中lncRNA linc00261的表达水平。

1.2.3 细胞增殖检测 转染lncRNA linc00261表达质粒、空载体的A549细胞及未转染的A549细胞分别为lncRNA linc00261组、阴性对照组、空白对照组,均培养于96孔板上,每组设置5个复孔,使用MTT法检测培养0、24、48、72、96 h后的细胞增殖情况。

1.2.4 细胞凋亡检测 收集转染48 h后的A549细胞及未转染的A549细胞,严格按照Annexin VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京凯瑞基生物科技有限公司)操作说明书进行细胞染色,于染色30 min内使用流式细胞仪(美国BD公司)进行检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.00处理数据,计量资料用表示,采用t检验或单因素方差分析进行数据比较;计数资料以例数表示,采用χ2检验进行数据比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA linc00261在NSCLC组织及癌旁组织中的表达 qRT-PCR检测结果显示,100例NSCLC患者癌组织中lnc RNA linc00261的相对表达量(0.15±0.06)明显低于癌旁组织(1.19±0.23),差异有统计学意义(t=7.753,P＜0.05)。

2.2 lncRNA linc00261的表达与NSCLC患者临床病理特征的关系 不同性别、年龄、肿瘤直径及病理组织类型的NSCLC患者癌组织中lncRNA linc00261相对表达量比较差异均无统计学意义(P值均＞0.05),但不同组织分化程度、临床分期及有无淋巴结转移患者癌组织中lncRNA linc00261相对表达量差异均有统计学意义(P值均＜0.05),见表1。

2.3 lnc RNA linc00261对A549细胞增殖及凋亡的影响 qRT-PCR法检测结果显示,转染lncRNA linc00261表 达 质 粒 的A549细 胞 中lncRNA linc00261的相对表达量显著高于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(F=5.196,P＜0.001),见图1。MTT检测结果显示,转染24 h后,3组之间细胞增殖能力差异无统计学意义(F=0.183,P＞0.05);转染48、72、96 h后,转染lnc RNA linc00261表达质粒的A549细胞的细胞增殖能力显著低于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(t=3.187、5.549,P值均＜0.05),见图2。流式细胞术检测结果显示,转染48 h后,转染lnc RNA linc00261表达质粒的A549细胞的凋亡比例显著高于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(χ2=4.175、6.093,P值均＜0.05),见图3。

3 讨论

lnc RNA在发现初期曾一度被认为是基因组转录过程中的 “噪音”[12],然而,随着研究的深入,人们开始发现lncRNA可在表观遗传学、基因组转录水平及转录后水平等多个层面上调控基因的表达[13-14]。据报道,lncRNA可通过影响肿瘤细胞增殖、迁移、抵抗凋亡、逃避生长抑制因子及促进血管生成等方面参与肿瘤的发生、发展过程[15-16]。近年来,尽管NSCLC治疗规范己逐步完善,开始出现新的化疗药物即靶向药物,但NSCLC的总体治疗效果并不理想[17]。因此,寻找新的研究方向,进一步探究NSCLC的分子生物学特点及发病机制,明确其早期诊断及治疗靶标,对于提高NSCLC的临床诊治具有重要意义,而目前引起广泛关注的lncRNA可能正是我们所要寻找的NSCLC研究的突破口。

表1 lncRNA linc00261的表达与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系()

表1 lncRNA linc00261的表达与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系()

病理特征 例数lncRNA linc00261相对表达量 统计值 P值性别 t=0.082 0.718 59 0.16±0.04女41 0.13±0.03年龄 t=0.592 0.431＜60岁 38 0.17±0.04≥60岁 62 0.14±0.03肿瘤直径 t=0.087 0.916＜5 cm 49 0.16±0.03≥5 cm 51 0.14±0.05病理组织类型 F=0.273 0.360腺癌 63 0.13±0.04鳞癌 28 0.14±0.05大细胞癌 9 0.16±0.05组织分化程度 F=6.117＜0.001低分化 49 0.06±0.02中分化 22 0.12±0.02高分化 29 0.24±0.07临床分期 F=5.269＜0.001Ⅰ期 14 0.19±0.06Ⅱ期 41 0.13±0.03Ⅲ期 45 0.07±0.03淋巴结转移 t=4.893＜0.001是53 0.09±0.03否47 0.21±0.06男

目前,在NSCLC中新发现多种lnc RNA[18],但迄今为止,lncRNA与NSCLC的关系尚不明确。lncRNA linc00261是近年来发现的一种在多种癌症进展中发挥抑癌作用的长链非编码RNA[19-20],但迄今有关lnc RNA linc00261在NSCLC中的作用尚未被研究。本研究通过qRT-PCR检测发现,100例NSCLC患者癌组织中lnc RNA linc00261的平均相对表达量明显低于癌旁组织(P＜0.05),表明lnc RNA linc00261在NSCLC组织中表达下调,可能与NSCLC的发病有关。本研究进一步分析了lnc RNA linc00261的表达与NSCLC组织中患者临床病理学特征的相关性,结果显示,不同性别、年龄、肿瘤直径及病理组织类型的NSCLC患者癌组织中lncRNA linc00261相对表达量比较差异均无统计学意义,但不同组织分化程度、临床分期及有无淋巴结转移患者癌组织中lncRNA linc00261相对表达量差异均有统计学意义,这提示lncRNA linc00261的表达与NSCLC的发生、发展有关,可能在NSCLC中发挥抑癌作用。由于lncRNA linc00261表达下调促进NSCLC的恶性转化,因此我们推测上调lnc RNA linc00261的表达可能是临床治疗NSCLC的一个潜在靶点。

图1 3组细胞中lncRNA linc00261表达水平的比较

图2 MTT法检测过表达lncRNA linc00261对A549细胞增殖的影响

图3 流式细胞术检测过表达lncRNA linc00261对A549细胞凋亡的影响 A:空白对照组;B:阴性对照组;C:lncRNA linc00261组

基于上述临床标本研究结果,本研究进行了体外细胞实验,初步探讨了过表达lnc RNAlinc00261对NSCLC细胞系增殖及凋亡的影响。MTT检测结果显示,转染24 h后,3组细胞增殖能力之间比较差异无统计学意义;转染48、72、96 h后,转染lnc RNA linc00261表达质粒的A549细胞的细胞增殖能力显著低于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,转染48 h后,转染lncRNA linc00261表达质粒的A549细胞的凋亡比例显著高于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(P＜0.05),提示上调lncRNA linc00261的表达可抑制NSCLC细胞增殖并诱导凋亡。

综上所述,lnc RNA linc00261在NSCLC患者癌组织中表达下调,并与NSCLC的发生、发展有关,其在NSCLC中可能发挥抑癌基因作用,过表达lnc RNA linc0026可抑制NSCLC细胞增殖并诱导凋亡,有可能成为NSCLC潜在的治疗靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突