石维维 陈复辉

1北京市大兴区人民医院呼吸内科102600;2哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸内科150086

目前肺癌已经成为全世界受累人数最多的恶性肿瘤,其发病率和病死率持续居高不下。同时肺癌也是预后最差的恶性肿瘤之一,虽然经过几十年的不懈努力,其5年生存率依然不到15%。因此,肺癌的早期诊断及治疗成为肺癌研究的重中之重。目前分子生物学和基因治疗的发展为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的依据survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,具有调控细胞周期和抑制细胞凋亡的作用,是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子。其在正常组织和分化良好的成人组织未见表达,但在人类胚胎组织和许多恶性肿瘤组织中表达显著。近年来,许多研究发现survivin基因单核苷酸多态性与人类的许多肿瘤存在相关性。由此使其成为肿瘤研究的焦点,为肿瘤的早期诊断、基因治疗提供了新的靶点。本研究旨在探讨survivin基因9194A/G位点单核苷酸多态性与肺癌的发生、发展相关性,并探讨吸烟因素对该位点多态性产生的影响。

1 对象与方法

1.1 试验材料

1.1.1 研究人群 纳入2011年3月至2012年4月哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸内科及肿瘤内科133例肺癌患者为肺癌组。其中吸烟患者为80例,非吸烟患者为53例。选取哈尔滨医科大学附属第二医院体检中心的健康人150名为对照组,其中吸烟者83例,非吸烟者67例,均无癌症病史和癌症家族史及其他严重疾病。对照组与肺癌组在性别、年龄构成上差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。本研究经受试者知情同意,符合 《赫尔辛基宣言》的原则。

1.1.2 标本的收集及保存 采集肺癌组和对照组晨起空腹的外周静脉血各5 ml,所有采集标本均以EDTA抗凝,应用氯仿-异戊醇法分离提取外周血基因组DNA,使用50μl TE液溶解DNA,并于-80℃冻存备用。

1.1.3 主要仪器及设备 水平净化工作台(SPDJ,上海浦东物理光学仪器厂),台式高速冷冻离心机(Neofuge13R,上海力申科学仪器有限公司),-80℃冰箱(中国海尔公司),普通冷冻冰箱(中国海尔公司),电泳仪(EPS300型,上海天能科技有限公司),凝胶自动成像系统(GI52010,上海天能科技有限公司),1.5 ml Eppendorf管、枪头、微量加样器(Eppendorf中国有限公司),温箱(HW-SY21-K4C,北京长风仪器仪表)。

1.1.4 主要试剂及储存方法 20%SDS;5 mol/L NaCl;氯仿-异戊醇;细胞裂解液、TE液、无水乙醇均订购于上海生物工程有限公司,分别存储于4℃、4℃和室温阴凉通风橱内;引物;2%琼脂糖凝胶;Cfr42I限制性内切酶;DNA扩增。

1.2 方法及步骤

1.2.1 外周血基因组DNA提取 取抗凝血500μl置于1.5 ml Ep管,后加入细胞裂解缓冲液1 ml,充分混合裂解。17 458×g离心5 min,弃去上层液。重复上述裂解1次。于沉淀物中加入500μl灭菌蒸馏水溶解红细胞。17 458×g离心10 min弃 去 上 清 液。 用80μl DNA稀 释 缓 冲 液(0.375 mol/L NaCI,0.12 mol/L EDTA)将沉淀轻轻重悬。加入15μl 20%SDS、100μl 5 mol/L NaCI充分混均30 s,再加入240μl无菌双蒸水、350μl氯仿-异戊醇(24∶1体积)混合液充分混均30 s。17 458×g离心3 min,将上清液转至另一Ep管。加入860μl无水乙醇颠倒混均数次至DNA絮状物析出。17 458×g离心3 min,弃去上清液,37℃自然干燥。50μl TE溶解DNA备用。

1.2.2 目的基因片段扩增 50μl反应体系包括5μl模板DNA、2μl正向引物、2μl反向引物、25μl 2×Taq Master Mix、16μl RNase-Free Water。将其置于PCR仪扩增,扩增条件为:引物 序 列(9194A/G位 点),正 向 引 物:5'-GAAGAAAGAATTTGAGGAAACCGC-3',反向引 物:5'-AAACCCTGGAAGTGGTGCAG-3'。survivin 9194A/G反应条件:95℃10 min变性,35个循环95℃30 s,60℃30 s and 72℃30 s,72℃10 min延伸。抽取DNA样本检测。

1.2.3 PCR产物过夜酶切 取10μl PCR反应混合物,18μl nuclease-free water,2μl 10×Buffer Tango,2μl Cfr42I配置反应体系。将配置好的反应体系配平离心后置于浮漂,放置于37℃温箱恒温孵育18 h。

1.2.4 酶切产物琼脂糖凝胶电泳 取已制备的2%琼脂糖凝胶,按既定顺序将DNA ladder 3μl、PCR扩增后的酶切产物5μl依次加入加样孔。将加样后的凝胶块置于水平电泳槽内,并自行标记。将加样孔一侧置于负极端,电泳通电电压设置200 V,接通电源电泳约20 min后(当蓝色条带电泳到整个胶块约2/3时)停止电泳。戴上无菌洁净橡胶手套,将凝胶块取出并置于凝胶自动成像系统。接通凝胶成像系统电源,打开主机菜单,设置相关参数后,显像并保存。取出凝胶块进入暗室,将凝胶块置于紫外线观察仪上进行人工肉眼条带分类,将分类结果依次记录下并与电脑结果比对,对有异议结果从新分析分类。并随机抽取10% DNA样本送往基因测序公司进行基因序列检测,验证本试验真实可靠性。

1.3 统计学分析 对照组与肺癌组9194A/G基因采用例数(百分比)表示,基因表达差异采用χ2检验。按照吸烟程度分层分析,吸烟与基因型的表达差异采用χ2检验。所有数据采用SPSS 18.0统计软件处理,双侧检验,α=0.05为检验水准,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 survivin 9194A/G位点酶切电泳结果 采用PCR连接的限制性片段长度多态性分析技术,将目的基因的DNA片段酶切后电泳,经凝胶成像系统显像。survivin基因在9194位点存在单核苷酸多态性,共3种基因型:AA型、GG型、AG型(图1)。

图1 经限制性内切酶Cfr42I酶切后凝胶成像图

2.2 酶切产物基因测序 survivin 9194A/G位点经酶切的基因片段产物进行基因测序后与电泳结果对比,结果符合率98%,数据真实可靠。测序后见图2。

2.3 基因型构成情况 对照组与肺癌组survivin 9194A/G位点基因构成情况差异无统计学意义(χ2=0.358,P=0.836),见表1。不同吸烟情况下,肺癌组survivin基因9194A/G位点构成情况与对照组差异均无统计学意义(P值均＞0.05),见表2。

图2 经酶切的基因片段产物基因测序后与电泳结果比对,结果符合率98%,数据真实可靠

表1 2组survivin基因9194A/G位点基因型构成比分析[例(%)]

3 讨论

2017年美国癌症学会统计数据显示肺癌仍是全世界发病率和病死率排名第一的癌症[1]。我国肺癌发病率和病死率近10年明显增高[2],严重威胁着人类的生命健康,并且给家庭社会造成了沉重的经济负担。因此,关于肺癌的早期诊断、有效治疗及预后成为全球密切关注的研究热点。

survivin是凋亡抑制蛋白家族的一名新成员,被认为是目前最强的凋亡抑制因子。survivin结构特殊,其N端含有半胱氨酸/组氨酸的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列结构域,相邻的C端缺少指环结构[3]。survivin不仅能够调节细胞周期参与细胞分化,而且能够抑制细胞的凋亡,已证实是由抑制蛋白重复区序列在凋亡抑制蛋白抑制细胞中发挥了抗凋亡作用[4]。其机制为干扰内源性凋亡信号通路上游启动子Caspase-9活化,并直接抑制Caspase-3和Caspase-7[5]。survivin的过表达可抑制细胞的凋亡,相反,survivin表达的降低可导致细胞的自发性死亡[6]。survivin表达具有选择性,在人类胚胎组织和多种恶性肿瘤组织中见广泛表达,但在正常组织和终末分化的成人组织中未见表达。有研究表明其在许多肿瘤的发生、发展中起到了重要的作用。另外它的表达可能与一些肿瘤的预后不良存在相关性[7]。因此,survivin可能成为一个很好的肿瘤候选易感基因,survivin功能多态位点可导致肿瘤的易感性。徐美玲等[8]研究表明,survivin基因31G/C位点多态性与小细胞肺癌的发生有一定相关性。而位于第四外显子的非同义survivin 9194A/G多态性位点功能目前尚未清楚,但可能与肿瘤发生相关联。结合既往相关文献,本研究选择了survivin 9194A/G多态位点,对其进行与肺癌发病风险的关联性研究。同时明确吸烟因素是否参与了这个基因位点多态性的产生,为肺癌的预防和诊治提供有力依据。

表2 2组吸烟与survivin 9194A/G位点单核苷酸多态性分析[例(%)]

国内外关于-9194G/A位点多态性的研究相对较少。Jang等[9]对582例韩国肺癌患者及528名健康人的病例对照研究发现,survivin基因9194A/G位点多态性与肺癌的易感性无明显相关性。而Kawata等[10]对235例膀胱癌患者和346名健康人进行survivin基因多态性的研究发现,9194A/G位点G等位基因的出现显著降低膀胱癌的发病风险。以C-A单倍体作对照,G-G单倍体可降低膀胱癌的发病风险。本研究中未发现survivin 9194A/G位点多态性与肺癌的易感性存在相关性,与Jang等[9]的研究结果相符。这些结果的差异性可能是因为不同肿瘤的组织来源不同,受基因多态性的影响程度不尽相同,或者survivin 9194A/G位点多态性的改变不能够导致肺癌的病理改变,从而不能对个体的肺癌易感性产生影响。在对survivin基因中的9194A/G位点基因多态性与吸烟因素的相关性研究中,本研究未发现基因多态性与吸烟之间存在关联,吸烟因素可能不参与这个位点基因多态性的产生。

肺癌的发生和发展是多基因参与、多种因素、多个步骤和多个阶段的分子事件。在本研究中只对survivin基因中的9194A/G位点进行了多态性的研究,未来有必要对这一基因的不同位点进行单独的及联合分析,并且以人群为基础,加大样本量进一步证实,为阐明肺癌的发病机制和为临床治疗开辟新的途径。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突