魏慧 张卿

1内蒙古自治区人民医院呼吸与危重症医学科,呼和浩特010010;2内蒙古医科大学第一附属医院呼吸内科,呼和浩特010010

肺癌是临床发病率、病死率居于各种恶性肿瘤之首[1]。临床患者中约60%～68%发现肺癌时已属晚期,已失去了手术机会,目前治疗主要以含“铂类方案”为主[2],但其不良反应较多导致患者依从性差、生活质量降低,且易产生耐药现象。

有研究表明,随着肿瘤细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达增加[3],肺癌移植瘤微血管密度(ministerstvo vnutrennikh del,MVD)增高[4],MVD表达高,肿瘤组织可以获得充足的血液供应,满足了肿瘤细胞快速生长的需要,癌细胞更易于生长和转移[5]。MVD计数越高,表明肿瘤的新生血管越多,肿瘤生长越快,而且与肿瘤患者临床分期及肿瘤的生长、转移呈正相关性[6]。

抗肿瘤血管生成治疗,并联合细胞毒药物化疗,已经成为当今肿瘤治疗领域的研究热点之一。本研究构建肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型,以尼美舒利(nimesulide,NIM)、顺铂(cisplatin,DDP)对肺癌荷瘤鼠进行药物干预,计算干预后裸鼠移植瘤的抑瘤率,用免疫组织化学的方法检测药物干预后裸鼠移植瘤新生血管密度,以及相关血管生长因子VEGF的蛋白表达,以明确选择性环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂NIM联合DDP对肺癌新生血管的影响,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

1.1.1 细胞株 人肺癌细胞株A549购买于中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所,培养于内蒙古医科大学临床研究中心细胞培养室。

1.1.2 实验动物 4周龄雌性BALB/C裸鼠36只,体质量16～18 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。裸鼠饲养于内蒙古医科大学临床医学研究中心裸鼠室(SPF级),实验裸鼠许可证号:SCXK(京2012-0001)。

1.1.3 主要试剂及生化材料 (1)胎牛血清、胰蛋白酶、RPIM-1640培养基购自美国Gibco公司;(2)COX-2抗 体、TGF-β 抗 体 购 自 美 国Santa Cruz Biotechnology公司,生产批号:sc-166475、sc-130348;(3)VEGF、b-FGF鼠抗人单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司,产品编号:MAB-0243、RAB-0305;(4)DDP冻干粉购自山东齐鲁制药厂;(5)NIM购自安徽仁和药业有限公司;(6)裸鼠生长繁殖饲料购自北京科澳协力饲料公司;(7)KIT-5010试剂盒、EDTA修复液Max Vision试剂盒(鼠/兔,生产批号:150121407C)购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养肺癌A549细胞株 RPIM-1640培养基80%,胎牛血清19%,双抗1%,配成完全培养基,培养A549细胞,置于37℃,5% CO2饱和湿度恒温培养箱中,细胞即可扩增,取对数生长期细胞传代。

1.2.2 细胞计数 细胞生长呈对数生长期时,用于细胞计数。细胞数/ml=4大格细胞总数×稀释倍数×104/4;每一大格的体积为=0.1 cm×0.1 cm×0.01 cm=10-4ml。

1.2.3 构建肺癌A549裸鼠移植瘤模型 36只裸鼠无菌饲养3 d后行荷瘤术。取对数生长期A549肺腺癌细胞,用胰酶消化后,溶于PBS液中离心3次,189×g每次离心5min,细胞计数1×107/ml的细胞悬液,无菌操作注射于裸鼠背部皮下组织,0.2 ml/只。

1.2.4 实验分组和药物干预 荷瘤后密切观察并测量瘤径,待瘤径约4～5 mm时,即荷瘤8 d时,36只裸鼠中4只未成瘤,将32只荷瘤鼠随机分为对照组、NIM组、DDP组、NIM+DDP组,每组8只,做好标记。

1.2.5 标本采集和固定 用药21 d结束后停药,第22天测量瘤径后处死裸鼠,剥离皮下移植瘤,并称瘤重,迅速放入福尔马林溶液中,固定48 h后修剪、冲洗、脱水、固定、包埋等,待切片做免疫组织化学、HE染色。

1.2.6 药物对肿瘤生长的抑制效应 体积抑制率=(对照组移植瘤体积-用药组瘤体积)/对照组瘤体积×100%;

1.2.7 对肺癌A549裸鼠移植瘤组织内血管生长因子进行测定 采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织内VEGF,并用CD31标记微血管,计算肿瘤组织MVD。基本步骤:(1)石蜡包埋,组织切片4μm。(2)烤片:65℃烤片。(3)脱蜡、水化:二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10 min。一次浸泡于无水乙醇水化。(4)抗原修复:放入高压锅中,加入EDTA溶液,至沸腾2 min,冷却后PBS浸泡。(5)去过氧化物酶:将切片放入3% H2O2溶液中浸泡10 min,水冲洗,PBS 3 min。(6)加一抗:VEGF、CD31使用福州迈新即用型一抗,室温孵育1 h。PBS缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各洗3 min。(7)加二抗:福州迈新即用型二抗(鼠/兔)覆盖组织表面,室温孵育20 min。水冲洗1 min,PBS缓冲液洗3 min。(8)DAB显色:将DAB溶液滴于组织表面,在显微镜下观察,水冲洗5 min。(9)苏木精复染:浸泡5 min,水冲洗3 min。(10)HCl分化:放入1% HCl溶液中5 s,水冲洗2 min。(11)脱水、透明,封片、镜检、采集。

1.2.8 结果判定 应用免疫组织化学和形态计量方法,用CD31标记微血管,置于显微镜下,计数采用微血管金标准法[7]。阳性细胞数评定法:采用9分评分制,按照阳性细胞率和染色强度分别计分。

1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0(SPSSInc,Chicago,USA)软件进行统计分析。正态性检验采用单样本K-S拟合优度法。计量资料以表示,两样本间比较采用t检验。多个样本间不同时间点的数据比较采用重复测量资料的方差分析,多组之间两两比较采用P值修正的方法。计数资料以例数(百分比)表示,数据间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 各组肺癌A549裸鼠移植瘤体积的变化(mm3,)

表1 各组肺癌A549裸鼠移植瘤体积的变化(mm3,)

注:NIM为尼美舒利;DDP为顺铂;与对照组比较,a P＜0.001;与NIM组比较,b P＜0.001;与DDP组比较,c P＜0.001

组别 鼠数移植瘤体积1 d 5 d 9 d 13 d 17 d 21 d对照组 8 34.73±10.10 112.58±36.94 273.63±76.67 393.43±114.59 502.82±150.84 598.78±157.79 NIM组 8 33.31±8.45 102.95±34.95 220.02±68.33 313.45±66.17 400.49±71.61 460.88±89.10 DDP组 8 32.45±12.58 104.87±42.33 157.01±43.18 225.37±67.23 283.04±79.84 314.51±94.09 NIM+DDP组 8 34.97±8.92 83.28±14.09 114.24±20.55abc 150.68±26.29abc 185.35±28.21abc 208.19±33.90abc F值 0.111 1.088 12.232 15.656 17.435 21.723 P值 0.953 0.371 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2 结果

2.1 成功构建肺癌A549裸鼠移植瘤模型 裸鼠条件、细胞生长条件统一,荷瘤过程顺利。移植瘤生长过程中,开始裸鼠背部皮下形成圆形、椭圆形、不规则形结节,早期肿瘤呈灰白色,表面光滑,之后肿瘤逐渐增大。

2.2 各组肺癌A549裸鼠移植瘤体积变化 各组裸鼠移植瘤生长快慢依次为对照组＞NIM组＞DDP组＞NIM+DDP组。第9天后各时间点NIM+DDP组移植瘤体积分别与DDP组、NIM组、对照组比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.05),见表1。

2.3 各组肺癌A549裸鼠移植瘤的体积抑瘤率 用药期间各组肺癌A549裸鼠移植瘤的体积抑瘤率见表2。各组裸鼠移植瘤的体积抑瘤率总体表现为NIM+DDP组＞DDP组＞NIM组＞对照组,NIM+DDP组对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用最强。

表2 各组肺癌A549裸鼠移植瘤的体积抑瘤率的变化(%)

2.4 各组肺癌A549裸鼠移植瘤MVD 各组肺癌A549裸鼠移植瘤MVD的表达情况见图1。NIM+DDP组MVD较DDP组低(P＜0.05),各组之间与对照组相比较(P值均＜0.05),见表3。

2.5 各组肺癌A549裸鼠移植瘤细胞VEGF的表达 VEGF在各组肺癌A549移植瘤中的阳性表达呈对照组＞NIM组＞DDP组＞NIM+DDP组(图2)。4组肺癌A549移植瘤中VEGF的表达比较差异有统计学意义(χ2=36.271,P＜0.001),对照组与NIM组VEGF表达比较,差异无统计学意义(χ2=0.687,P＞0.05);NIM+DDP组与DDP组VEGF表达比较,差异有统计学意义(χ2=8.055,P＜0.001),见表4。

图1 各组肺癌A549裸鼠移植瘤细胞中微血管密度的表达 免疫组织化学染色 ×400 A:对照组;B:尼美舒利组;C:顺铂组;D:尼美舒利+顺铂组

表3 各组肺癌A549移植瘤微血管密度的比较()

表3 各组肺癌A549移植瘤微血管密度的比较()

注:NIM为尼美舒利;DDP为顺铂;与对照组比较,a P＜0.05;与NIM组比较,b P＜0.05;与DDP组比较,c P＜0.05

组别 鼠数 微血管密度对照组 8 36.75±6.139 NIM组 8 27.25±5.142a DDP组 8 20.25±4.323ab NIM+DDP组 8 13.88±3.723abc F值 27.861 P值 ＜0.001

表4 各组肺癌A549移植瘤中血管内皮生长因子的表达

3 讨论

任何肿瘤生长与增殖都离不开新生血管,肿瘤生长需要血管来提供所需的营养物质[8]。肿瘤血管的形成过程分2个期:非血管期——处于无血管的浸润前期,此时主要靠弥散获得营养;血管期——在多种血管调节因子的作用下,新生血管长入肿瘤组织使肿瘤细胞呈指数生长,肿瘤细胞分裂率与血供呈正比。新生血管形成的整个过程是受新生血管调节因子的严密调控,肿瘤细胞自身分泌的生长因子作用于其自身的生长受体,形成自分泌循环,刺激新生血管的不断增殖,保持肿瘤细胞无休止的生长与浸润[9]。塞来昔布是一种选择性COX-2抑制剂。有研究报道,DDP和塞来昔布通过下调LRP m RNA和VEGF蛋白水平,协同作用于TW03/DDP细胞的增殖抑制和凋亡诱导[10]。

肿瘤的生长必须依赖足够的血供,有学者认为切断肿瘤血供,采用 “饥饿疗法”则可抑制肿瘤生长,导致肿瘤死亡[11]。因此,抗肿瘤新生血管形成环节成为治疗肿瘤的一个重要靶点,VEGFA和ANGPT2的联合检测可能是有价值的预后生物标志物,血管内皮生长因子A和血管生成素的双阻断可能改善治疗结果。抗血管生成疗法应运而生,联合传统化疗法成为研究热点。

COX-2是前列腺素合成过程中的限速酶[12],正常生理状态未见其表达,在血管生长因子分泌过多、癌基因刺激下,机体COX-2表达增强,并通过前列腺素、血栓素途径,刺激VEGF表达增强,抑制内皮细胞凋亡。CD34+血管形成(新生血管)。COX-2抑制剂的抗转移作用表明,这些分子可能在晚期癌症的治疗中具有临床应用价值。

图2 各组肺癌A549裸鼠移植瘤细胞中的血管内皮生长因子的表达 免疫组织化学染色 ×400 A:对照组;B:尼美舒利组;C:顺铂组;D:尼美舒利+顺铂组

选择性COX-2抑制剂可以通过抑制VEGF的m RNA的转录过程来抑制结肠癌血管形成,进而抑制结肠癌。在塞来昔布处理的LSQCC细胞系中发现了几个重要的分子,如VEGFA、ATF4、FN1、COX-2,这些分子可能增强了塞来昔布对LSQCC的抗癌作用[13]。有研究证实,在体外,COX-2抑制剂联合传统化疗药能使其半数抑制浓度最高减少至7%[14];在体内,COX-2抑制剂联合奥沙利铂在治疗肠癌中不仅具有抗细胞增殖,而且具有抑制新生血管的作用,发挥协同抗肿瘤作用[15]。本实验结果显示NIM组、DDP组、NIM+DDP组体积抑瘤率分别为23.03%、47.48%、65.23%。NIM组体积抑瘤率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),说明NIM具有抑瘤作用。4组体积抑瘤率比较差异有统计学意义(P＜0.05),且NIM+DDP组体积抑瘤率最高,表明NIM对肺癌A549裸鼠移植瘤有抑制作用,NIM+DDP对肿瘤生长的抑制作用更强,推测NIM单独应用有抑制肺癌生长的作用,而且NIM有增强肺癌细胞对DDP的细胞毒作用,即协同化疗药物发挥抑制肺癌A549裸鼠移植瘤生长的作用。

抗血管生成药物可以抑制肿瘤血管结构和功能,促进化疗药物进入肿瘤内部,造成肿瘤组织缺氧状态并且增强化疗药物的细胞毒作用。抑制COX-2和表皮生长因子受体可以通过正常肿瘤血管和程序性死亡1配体下调改善程序性死亡1检查点阻断治疗。通过影响血管和免疫细胞,可能是治疗人类肺癌的一种有前途的联合策略[16]。目前我们虽然不能通过检测肿瘤缺氧情况来判定肿瘤状态和治疗效果,但可以通过新生血管生成来间接评价肿瘤的氧供状态,MVD是最常用的测量新生血管密度的指标之一[17]。为了判断NIM单独以及联合DDP对肺癌新生血管的影响,本研究成功建立肺癌A549裸鼠移植瘤模型,结果显示NIM组MVD与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),4组MVD比较差异有统计学意义(P＜0.05)。MVD的变化趋势与肿瘤体积大小变化趋势一致,可能随着MVD的增加,血管生成越多,肺癌肿瘤生长越旺盛。有研究表明,联合使用COX-2抑制剂和奥沙利铂,可以降低MVD,显著增强奥沙利铂对结肠癌新生血管的抑制,促进肿瘤细胞死亡[18]。因此,笔者推测选择性COX-2抑制剂联合铂类化疗药物可以通过抑制肿瘤的MVD,从而达到抑制肿瘤的生长、浸润和转移。

VEGF是一种典型的外分泌蛋白,它可以与血管内皮细胞的膜受体结合,从而发挥促血管形成功能,是肿瘤组织生长和转移的必要条件之一。本研究的免疫组织化学结果显示,各组肺癌A549裸鼠移植瘤细胞均有VEGF阳性染色位于胞浆,呈棕黄色弥漫着色。4组阳性表达比较差异有统计学意义(P＜0.05),NIM组的阳性表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),提示NIM单独使用对VEGF的下调作用不明显,当与DDP联合作用于肺癌A549裸鼠移植瘤时,明显抑制VEGF的表达,且抑制效果优于NIM组及DDP组。Kim等[19]研究表明COX-2是一种酶,其表达受多种刺激(如炎症)诱导;塞来昔布触发COX-2外泌体负载。塞来昔布在肺癌细胞中诱导COX-2的表达,并且外泌体中高表达的COX-2可以转移到其他细胞中。选择性COX-2抑制剂通过下调胆道肿瘤细胞VEGF的蛋白表达起到抑制胆道肿瘤生长的作用。另有研究表明,选择性COX-2抑制剂可以通过抑制PG的产生,能够减少毛细血管再生,降低VEGF、b-FGF的表达,从而起到抑制肿瘤血管形成,进而抑制肿瘤细胞生长的作用,血管生成的抑制是癌症的一个典型特征,在包括非小细胞肺癌在内的多种人类恶性肿瘤中,血管生成的抑制已被证明是有效的[15]。因此,笔者推测选择性COX-2抑制剂联合化疗药物对肿瘤的抑制作用,可能与选择性COX-2抑制剂联合化疗药物对肿瘤VEGF的下调有关,并抑制肿瘤生长的作用。

本研究发现NIM对肺癌A549裸鼠移植瘤的新生血管有抑制作用,进而抑制肺癌的生长、增殖。NIM和DDP联合抑制肺癌的生长,可能与下调血管生长因子VEGF,降低肺癌MVD,减少肺癌的血液供应等因素有关。结合国内外研究,笔者推测选择性COX-2抑制剂联合铂类药物对肺癌的抑制作用与其抑制肺癌细胞增殖生长、促进肺癌细胞凋亡、提高机体免疫以及逆转耐药等机制有关。选择性COX-2抑制剂与DDP联合对肺癌新生血管的抑制效应,也可能为其抗肿瘤的机制之一。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突