龙 驹

(1 广西钦州市妇幼保健院，2 广西钦州市地方病细胞与分子生物学重点实验室，钦州市 535099，电子邮箱：lab@longju.net)

地中海贫血(地贫)是一种严重危害人类健康的单基因遗传病。我国南方沿海地区人群中，地贫致病基因的携带率较高，其中广西人群的地贫基因携带率最高[1]，高达25%[2]。地中海贫血的分子生物学机制为血红蛋白珠蛋白基因簇的变异，在广西人群中，导致α地贫的α珠蛋白基因簇变异在人群中的携带率高达17%[3]。由于重度α地贫会导致血红蛋白Barts胎儿水肿综合征，中间型α地贫会导致血红蛋白H病，因此在广西人群中，血红蛋白Barts胎儿水肿综合征的发生率或生育中间型α地贫基因型新生儿的概率较高，α地贫防控形势较为严峻[4]。

目前，广西已经建成由省-市-县区防控机构组成的地贫三级防控体系。在各级地贫基因诊断机构中，广泛使用的α地贫诊断试剂的检测范围为4种缺失型α地贫基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3种非缺失型α地贫基因突变(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在前期的研究中，本课题组检出了多种α地贫变异基因，其中-α21.9和-α2.4基因不在常规地贫检测试剂检测范围中，但在广西人群中的携带率较高[5]，这反映了以往对该区域人群α地贫基因研究的不足，应进一步分析该区域人群的α地贫基因频率，并重新划定纳入常规地贫基因分析的基因型范围，以免造成漏诊。钦州市妇幼保健院在北部湾沿海城市医疗行业中处于中心位置，除了本市样本外，还有大量来自防城港市和北海市(含市辖县)的样本在该院进行地贫基因检测。因此，本研究采用同源片段相对定量法、片段分析法和常规地贫基因检测试剂盒，分析2018～2019年钦州市妇幼保健院采集的样本，以明确广西南部(主要包括钦州市、防城港市、北海市)人群中α地贫基因的携带情况，并探讨该区域常规α地贫基因检测范围以避免漏诊。

1 材料和方法

1.1 样本来源 样本来源于2018～2019年钦州市妇幼保健院采集的4 000例常规地贫基因检测样本，其中2 900例来源自户籍为钦州市的个体，600例来源自户籍为防城港市的个体，500例来源自户籍为北海市的个体。所有受检个体均签署知情同意书。本研究已通过钦州市妇幼保健院伦理委员会审查。

1.2 试剂和仪器 常规地贫基因检测试剂购自益生堂生物企业有限公司(批号：20190502)和亚能生物技术(深圳)有限公司(批号：A2019090006)，检测范围包括4种缺失型α地贫基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)、3种非缺失型α地贫基因突变(αCSα、αQSα和αWestmeadα)，以及17种β地贫基因突变(βCD41-42、βIVS-Ⅱ-654、βCD17、β-28、β-29、β-30、β-32、βCD26、βCD71-72、βCD43、βIVS-Ⅰ-1、β27/28、βInt M、βCD31、βCap+40-43、βCD14-15和βIVS-Ⅰ-5)。使用的检测仪器包括3500基因分析仪(美国Life Technologies公司)、CFX96实时荧光分析系统(美国Bio-Rad公司)、Veriti GeneAmp PCR仪(美国Life Technologies公司)等。

1.3 检测方法 常规地贫基因检测试剂盒严格按照说明书使用流程完成操作。α基因拷贝数变异检测采用本课题组自研的基于同源片段相对定量法的定量PCR检测体系[6]；其他罕见地贫基因采用本实验室自研的定量荧光PCR体系和测序法完成[7]。基于同源片段相对定量法的定量PCR检测体系，其检测目标为α1和α2基因拷贝数变异情况，并结合常规地贫基因检测结果初步判断是否存在罕见地贫基因变异，再采用多重连接探针扩增技术、裂口PCR、测序法等进行验证；定量荧光PCR体系用于快速筛查本实验室偶有检出的热点α地贫基因突变，阳性结果采用测序法进行验证。

2 结 果

2.1 常规α地贫基因分析结果 在4 000例检测样本中，使用常规地贫基因检测试剂盒共检出1 713例α地贫基因阳性样本，最主要的基因类型为缺失型地贫基因，其中以--SEA缺失最为常见。见表1。

表1 1 713例α地贫基因阳性样本的基因型分布情况

2.2 罕见型基因筛查结果 采用同源片段相对定量法的定量PCR检测体系以及定量荧光PCR体系，共检出17例提示存在罕见地贫基因但常规基因分析显示正常的样本。经测序、跨越断点式PCR[1](即Gap-PCR)验证后，这17例样本的基因突变类型包括2.4缺失(-α2.4)、香港型(HKαα)、HBA2:c.91_93delGAG、HBA2:c.91G>C、钦州型缺失(-α21.9)、融合基因(Fusion)，见表2。融合基因测序结果见图1[8]。

表2 17例罕见型α地贫基因阳性样本的基因型

图1 融合基因(Fusion)的测序结果图

2.3 综合分析结果 在4 000例检测样本中，采用常规基因检测试剂检出1 713例阳性样本，采用辅助方法筛查出17例阳性样本，其中1例常规基因检测结果为--SEA/αα的样本确认携带有-α2.4基因，实际阳性样本应为1 729例。1 729例阳性样本共包含1 833个α地贫突变(部分为α地贫双重杂合子)，最常见的3种类型依次为--SEA、-α3.7和-α4.2，其余罕见地贫基因偶有检出，见表3。

表3 1 833个α地贫突变的类型

3 讨 论

目前，在广西地贫三级防控体系中，地贫基因检测实验室所使用的通用检测试剂盒检测范围一般包括4种缺失型α地贫基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3种非缺失型α地贫基因突变(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在广西人群中，偶有研究组报告检出罕见地贫基因，而这些基因大部分是由于血液学数据与基因型数据不匹配，进而采用进一步的检测手段所测出的[8-10]。

本课题组构建了基于同源片段相对定量法的定量PCR检测体系，该体系选择目标序列的原则为寻找序列中的同源片段，确保同源片段的两端有共同的可以用于构建PCR体系引物端的序列，根据分子生物学序列特征构建探针或者采用单侧荧光标记体系，使用热启动酶的PCR体系进行优化，优化至理论结果与实际检测结果大致吻合为止。本研究采用常规地贫基因检测试剂盒以及自研检测体系，对4 000例样本进行α地贫基因的检测，结果显示，该人群携带的主要α地贫基因或基因突变类型为--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα，但依然检测出罕见地贫基因突变，包括-α2.4、--THAI、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)。在以往的研究中[5，8]，我们多次检出了基因型为--SEA/-α2.4和--SEA/-α21.9的血红蛋白H病患者，也检出了多例携带HKαα或--THAI基因的个体。这反映了以上4种基因的重要性。在日常地贫筛查中，血常规检测仪器的准确性是影响地贫筛查结果准确性的重要因素，但部分个体接受地贫基因检测时甚至没有进行血常规检测而直接进行常规地贫基因分析。未提供受测者的血常规数据、血常规检测数据不准，或者静止型地贫对血常规的影响较小，是导致这些α地贫基因漏检的重要因素。

在α地贫基因分析中，--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα作为主要α地贫基因的检测范围已经沿用了十几年。近5年来，广西质量控制机构意识到--THAI基因的重要性，要求防控机构将该基因纳入检测范围。因此，广西的主流地贫基因检测实验室的α地贫基因检测范围大多数为--SEA、--THAI、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα。而最近有研究揭示了-α2.4、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)在该区域地贫基因检测中的重要性[5，8，11]，因而检测机构应根据自身实际情况逐步将这些基因纳入常规基因检测范围内，尤其是-α2.4和-α21.9应纳入必检范围，避免这些重要基因的漏检。