李红月 辛晓蓉

(1 青海仁济医院眼科，西宁市 810000，电子邮箱：lihongyue197802@163.com；2 青海红十字医院眼科，西宁市 810000)

在我国，原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)是青光眼的主要类型，其主要因瞳孔阻滞等促使房角关闭、引发眼内压升高而导致的[1]。研究显示，绝大部分PACG患者具有瞳孔阻滞与房角变窄等特征[2]。目前，PACG致盲率仍呈增加趋势[3]，有关基因突变在PACG发生过程中作用的研究较多[4]。因此，需从基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)进一步分析PACG的发生及发展机制。以往研究表明PACG与多种基因突变有关，而基因SNP可参与PACG发生及发展过程[5]。三磷酸腺苷结合盒转运子A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1，ABCA1)基因多态性与原发性开角型青光眼的易感性有关[6]。相关研究表明，三磷酸腺苷结合盒转运子C5(adenosine triphosphate-binding cassette transporter C5，ABCC5)可在心脏、脑及眼角膜等组织中表达，并在多种疾病发生中发挥重要作用[7]。目前，尚未见有关藏族人群ABCA1、ABCC5基因SNP的研究报道。因此，本研究选取青海省藏族患者为研究对象，探讨ABCA1、ABCC5基因SNP与PACG的关系，旨在为丰富PACG发病机制及提高诊疗效果提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年3月至2018年4月于青海仁济医院及青海红十字医院就诊的96例PACG患者为研究组，均符合PACG诊断标准[8]，且户口登记为藏族，在青海地区居住时间≥5年。其中男性71例，女性25例，年龄为58～72(68.49±7.42)岁。另选取两院同期收治的72例单纯老年性白内障患者为对照组，均符合老年性白内障诊断标准[9]，且户口登记为藏族，在青海地区居住时间≥5年，其中男性47例，女性25例，年龄为56～70(66.32±11.05)岁。所有研究对象纳入标准：(1)无PACG家族史；(2)未合并其他类型眼部疾；(3)对本研究知情且签署同意书。所有研究对象排除标准：(1)合并青光眼性视神经损伤；(2)既往有眼内手术史；(3)患有内分泌疾病；(4)心、肝等重要脏器严重损伤；(5)干眼症。两组患者的性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器：DNA提取试剂盒购于赛泰克生物科技有限公司(批号：K368-50RXN)；NanoDrop 2000C核酸检测仪购于美国Thermo Fisher Scientific公司，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(型号：T100 Thermal Cycler)、电泳仪(PowerPac系列)均购自美国Bio-Rad公司，DBT-2000凝胶成像仪购自美国Uvipro公司。

1.2.2 血液样本采集：所有患者均于清晨空腹状态下采集静脉血7 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝试管内，于-20℃保存用于提取基因组DNA。

1.2.3 基因分型方法：采用DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，并应用细胞裂解及血红素/蛋白沉淀技术纯化基因组DNA。ABCA1、ABCC5基因分型均采用PCR结合限制性内切酶片段长度多态性方法，ABCA1基因rs914545、ABCC5基因rs1401999位点单碱基延伸引物及PCR扩增引物的合成均由上海生物芯片有限公司完成。PCR反应体系共15 μL，包括10×缓冲液1.5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸0.3 μL，氯化镁0.9 μL，水生栖热菌DNA聚合酶0.1 μL，引物各0.5 μL，DNA样本1 μL，用离子水补充至15 μL。PCR反应条件为95℃ 15 min，95℃ 40 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，72℃延伸8 min。PCR扩增后，取PCR产物10 μL，加入2 μL 5U内切酶Alu I、2 μL 10×酶切缓冲液和6 μL双蒸水组成20 μL反应体系，37℃水浴酶切过夜。取PCR产物1.5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，将其置于凝胶成像系统观察电泳条带，回收PCR产物并由上海生工生物公司进行序列测定。

1.3 眼科参数的检测 应用PENTACAM三维眼前节分析诊断系统(德国OCULUS公司)检测前房深度、前房容积、前房夹角等[10]。应用尼德克综合验光仪(上海涵飞医疗器械有限公司)检查最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)；运用非接触眼压计(上海寰熙医疗器械有限公司，型号：Canon TX-20型)测量眼压；采用超声生物显微镜[西化仪(北京)科技有限公司，型号：MD-300L]测量中央前房深度(central anterior chamber depth，CACD)；采用全自动电脑视野分析仪(德国Zeiss公司，型号：Humphery 750)检测视野平均缺损；应用高分辨率光学相干断层扫描仪(德国Zeiss公司，型号：CIRRUS HD-OCT 4000)测量平均视网膜神经纤维层(mean retinal nerve fiber layer，mRNFL)厚度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验；计数资料用[n(%)]表示，比较采用χ2检验；采用Logistic回归模型分析PACG发生的相关影响因素；采用Hardy-Weinberg定律检验两组基因型是否符合遗传平衡。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者的眼部参数比较 研究组的前房深度、前房容积、BCVA、CACD低于对照组，而眼压高于对照组(均P<0.05)，两组患者前房夹角、视野平均缺损、mRNFL厚度差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 两组患者的眼部参数比较(x±s)

2.2 ABCA1基因rs914545位点、ABCC5基因rs1401999位点基因分型 ABCA1基因rs914545位点存在SNP(即G→T)：(1)野生型GG型，两条DNA条带，分别为101 bp、65 bp；(2)突变杂合子GT型，两条DNA条带，分别为129 bp、94 bp；(3)突变纯合子TT型，1条DNA条带，为166 bp。ABCC5基因rs1401999位点存在SNP(即G→T)：(1)野生型纯合子CC型，1条DNA条带，为167 bp；(2)突变杂合子CG型，两条DNA条带，分别为129 bp、200 bp；(3)突变纯合子GG型，1条DNA条带，为230 bp。见图1。

图1 ABCA1、ABCC5基因位点PCR扩增产物酶切片段电泳图

注：1～3分别为ABCA1基因rs914545位点GG、GT、TT基因型；4～6分别为ABCC5基因rs1401999位点CC、CG、GG基因型。

2.3 遗传平衡检验 两组ABCA1、ABCC5基因位点实际值与预测值差异无统计学意义(均P>0.05)，且各基因型频率稳定，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。见表2及表3。

表2 ABCA1基因rs914545位点基因型遗传平衡检验[n(%)]

表3 ABCC5基因rs1401999位点基因型遗传平衡检验[n(%)]

2.4 两组基因型及等位基因分布比较 两组ABCA1基因rs914545位点基因型及等位基因分布差异有统计学意义(均P<0.05)，其中研究组TT基因型频率高于对照组，T等位基因频率高于对照组(均P<0.05)。两组ABCC5基因rs1401999位点基因型及等位基因分布差异有统计学意义(均P<0.05)，其中研究组GG基因型频率高于对照组，G等位基因频率高于对照组(均P<0.05)。见表4及表5。

表4 两组ABCA1基因rs914545位点基因型及等位基因分布[n(%)]

表5 两组ABCC5基因rs1401999位点基因型及等位基因分布[n(%)]

2.5 PACG发病相关影响因素 将是否发生原发性闭角型青光眼作为因变量(0=不发生，1=发生)，校正前房深度、前房容积、BCVA、眼压、CACD等混杂因素后，以ABCA1三种基因型GG型、GT型、TT型，ABCC5三种基因型CC型、CG型、GG型作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示ABCA1基因rs914545位点TT基因型、ABCC5基因rs141999位点GG基因型均为PACG发生的危险因素(均P<0.05)。见表6。

表6 PACG发病影响因素Logistic回归分析

3 讨 论

青光眼是一种通过损伤视神经及其通路进而降低视觉功能的综合征，分为原发性、继发性与先天性青光眼，根据房角解剖结构的不同将原发性青光眼分为PACG与原发性开角型青光眼。PACG发病原因较为复杂，且具有较高的致盲率，这是由于虹膜后方压力增高导致虹膜向前膨隆，阻塞小梁网并阻止房水流出，继而引发眼压增高导致患者视神经受损[11]。越来越多的研究表明，遗传因素在PACG发病过程中发挥重要作用[12]。研究显示，肌纤蛋白基因突变可导致青少年开角型青光眼的发生，同时肌纤蛋白基因rs183532位点SNP可增加原发性开角型青光眼的发病风险[13]。有学者发现，潜伏转化生长因子β结合蛋白2的基因多态性与PACG发病密切相关[14]。目前针对PACG的遗传学研究不够深入，不同种族、地域的人群研究结果不尽相同。

ABCA1是一种整合的膜蛋白，可促使胞内磷脂与游离胆固醇在细胞内外流入、流出，同时游离胆固醇还可与细胞表面载脂蛋白A-I结合进而促使高密度脂蛋白的形成[15]。Zhao等[16]的研究表明ABCA1基因突变可导致载脂蛋白、多种代谢酶活性及脂蛋白发生改变，对胆固醇逆转运过程产生重要影响，最终导致脂代谢紊乱。相关研究表明，ABCA1基因rs914545位点SNP可增加机体血脂水平升高及冠心病的发生风险[17]。蔡晖等[18]的研究表明ABCA1基因rs914545位点SNP与汉族人群原发性开角型青光眼易感性有关。关于ABCA1基因rs914545位点SNP与藏族人群PACG发病风险关系，尚未见研究报道。本研究结果显示，ABCA1基因rs914545位点存在SNP，为G→T，即TT为突变纯合子。研究组ABCA1基因rs914545位点TT基因型及T等位基因频率高于对照组(P<0.05)，这提示ABCA1基因rs914545位点SNP可能与PACG发生相关。

ABCC5又称为多药耐药性蛋白5(multidrug resistance-associated protein 5，MRP5)，其可通过抗癌药物等参与细胞信号转导过程[19]。相关研究表明，ABCC5主要在角膜、视网膜色素上皮细胞中表达，还可在虹膜、睫状体及晶体中表达，但参与细胞信号转导的具体作用机制尚未完全阐明[20]。同时ABCC5 mRNA表达还与老年性黄斑病变的发生及发展密切相关[21]。桑景荭等[22]通过统计反演及模拟演算对PACG患者易感基因位点进行检测，发现ABCC5基因多态性与PACG发病有关。但有关ABCC5基因rs1401999位点突变与PACG发病之间关系的研究相对较少。本研究结果显示，ABCC5基因rs1401999位点存在SNP，为C→G，即GG为突变纯合子。研究组ABCC5基因rs1401999位点GG基因型及G等位基因频率高于对照组(P<0.05)，说明ABCC5基因rs1401999位点SNP可能与PACG发生相关。

本研究进一步采用Logistic回归模型分析PACG发病的相关影响因素，结果显示ABCA1基因rs914545位点TT基因型、ABCC5基因rs1401999位点GG基因型均为PACG发生的危险因素(P<0.05)，提示ABCA1基因rs914545位点及ABCC5基因rs1401999位点SNP与PACG发生有关。

综上所述，ABCA1基因rs914545位点、ABCC5基因rs1401999位点SNP与PACG发病有关，携带ABCA1基因rs914545位点TT基因型及ABCC5基因rs1401999位点GG基因型者发生PACG的风险更大。但本研究仅纳入本地区部分藏族患者进行分析研究，而PACG是一种受多基因、地域、种族等多因素影响的疾病，ABCA1、ABCC5基因在PACG中的具体作用机制有待进一步研究。