殷少文，叶世芸，赵琳珺，王维，郑立肯

(贵州中医药大学实验中心，贵阳 550000)

风湿性关节炎(rheumatic arthritis)及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属于中医“痹症”范畴[1]，临床表现为关节肿胀、疼痛、变形伴有晨僵，发病率和致残率高[2-3]。其病因复杂，诱导因素众多，且可引发心理障碍，如抑郁症和焦虑症[4]。目前西医对该病以对症治疗为主，通过解热、镇痛、消除关节肿胀等缓解病情。除常规用药和手术治疗外，还可采用自体干细胞移植、T细胞疫苗以及间充质干细胞治疗，但使用范围受到很大限制[5-7]。中医药对于“痹症”“尪痹”“历节”等的治疗有独特理论体系，并且在临床取得良好的治疗效果。

强筋祛湿液基于“虚邪淤”理论，以补肝肾、强筋骨、祛风湿、止痹痛、散淤血、消肿痛为治疗原则，处方由防己、川牛膝、寻骨风、松节、羌活、续断、杜仲、海风藤、路路通、红花等药组成，具有祛风除湿、活血化瘀之功效，临床用于治疗风湿关节痛、关节肿胀、皮下损伤淤血、皮肤擦伤溃破等。该处方及工艺已经获得国家专利技术[8]。但处方缺乏质量标准及药效学研究，仅限于门诊使用。笔者在本实验建立该药的质量标准，以期达到质量可控、药效物质基础明确、推广有据的目的。

1 薄层色谱(TLC)实验

1.1仪器与试药 CAMAG Reprostar3薄层色谱成像系统、LINOMAT V半自动点样仪(瑞士卡玛公司)。防己对照药材(批号：120919-200304)、延胡索对照药材(批号：120928-201007)、独活对照药材(批号：120940-200809)、何首乌对照药材(批号：120934-201009)、丁香对照药材(批号：121039-201304)、川牛膝对照药材(批号：121065-200503)、杯苋甾酮对照品(批号：111804-201504，含量≥99%)、丁香酚对照品(批号：110725-201414，含量≥99%)、2，3，5，4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号：110844-200404，含量≥99%)均购于中国食品药品检定研究院。强筋祛湿液(贵州中医药大学实验中心制备，批号：20150501，20150502，20150503)，其他试剂均为分析纯。

1.2方法与结果

1.2.1防己的TLC鉴别 取强筋祛湿液10 mL，水浴蒸干，残渣加乙醇5 mL溶解，作为供试品溶液；另取防己对照药材0.35 g，加乙醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。按处方工艺，取缺防己药材的强筋祛湿液，按供试品溶液处理方式，得缺防己的阴性溶液。

吸取供试品溶液、对照药材溶液和缺防己的阴性溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%浓氨试液(6：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同的橙色斑点，阴性无干扰。结果见图1。

1.供试品；2.阴性对照；3.对照药材。

1.test sample；2.negative control；3.medicinal material control.

Fig.1TLCofStepheniaTephtetrandra

1.2.2延胡索的TLC鉴别 取强筋祛湿液20 mL，水浴蒸干，残留加水10 mL使溶解，加浓氨水调pH值至10，乙醚振摇萃取3次，每次10 mL，合并乙醚，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取延胡索对照药材0.35 g，加乙醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。按处方工艺，取缺延胡索药材的强筋祛湿液，按供试品溶液处理方式，得缺延胡索的阴性溶液。

吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性溶液各10 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9：2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中3 min后取出，挥尽板上吸附的碘，紫外灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显亮绿色荧光斑点，阴性溶液无干扰。结果见图2。

1.2.3独活的TLC鉴别 取强筋祛湿液25 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，超声处理30 min，作为供试品溶液。另取独活对照药材0.35 g，加甲醇10 mL，超声处理10 min，滤过，作为对照药材溶液；按处方工艺，制备缺独活药材的强筋祛湿液，按供试品溶液处理方式，得缺独活的阴性溶液。

吸取供试品、对照药材和阴性溶液各20 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(15：15：4)为展开剂，展开2次，取出，晾干，紫外光灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的粉色荧光斑点，阴性溶液无干扰。结果见图3。

1.供试品；2.阴性对照；3.对照药材。

1.test sample；2.negative control；3.medicinal material control.

Fig.2TLCofRhizomaCorydalis

1.2.4何首乌的TLC鉴别 取强筋祛湿液25 mL，水浴蒸干，残渣加乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取何首乌对照药材0.35 g，加乙醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。按处方工艺，取缺何首乌药材的强筋祛湿液，按供试品溶液处理方式，得缺何首乌的阴性溶液。取2，3，5，4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每毫升含0.2 mg的溶液，即得对照品溶液。

吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性溶液各20 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(7：3)为展开剂，展至约3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇(10：1)为展开剂，展至约7 cm，取出，晾干，紫外光灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同蓝色的荧光斑点，阴性无干扰。结果见图4。

1～3.供试品；4.对照药材；5.阴性对照。

1-3.test sample；4.medicinal material control；5.negative control.

Fig.3TLCofradixangelicaepubescentis

1～3.供试品；4.对照药材；5.二苯乙烯苷；6.阴性对照。

1-3.test sample；4.medicinal material control；5.stilbene glycoside；6.negative control.

Fig.4TLCofpolygonummultiflorum

1.2.5丁香的TLC鉴别 取强筋祛湿液25 mL，加石油醚(60～90 ℃)5 mL，摇匀，静置至完全分层，取上层液，作为供试品溶液；另取丁香对照药材0.35 g，加乙醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。

按处方工艺，取缺丁香药材强筋祛湿液25 mL，按供试品溶液制备方法制备，得缺丁香的阴性溶液。取丁香酚对照品适量，精密称定，加石油醚(60～90 ℃)制成每毫升含2 mg溶液，即得对照品溶液。

吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性溶液各20 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰，紫外灯(波长365 nm)下检视[6]，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同淡绿色荧光斑点，阴性无干扰。结果见图5。

1～3.供试品；4.对照药材；5.丁香酚；6.阴性对照。

图5 处方中丁香的薄层色谱图

1-3.test sample； 4.medicinal material control； 5.eugenol； 6.negative control.

Fig.5TLCofSyzygiumaromaticum

1.2.6川牛膝的TLC鉴别 取强筋祛湿液25 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，加于中性氧化铝柱上(100～200目，3.5 cm，内径2 cm)，用甲醇-乙酸乙酯(1：1)40 mL洗脱，收集洗脱液，水浴挥干，残渣加甲醇使溶解，定容至2 mL，即得，作为供试品溶液。另取川牛膝对照药材0.35 g，加甲醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。按处方工艺，取缺川牛膝的强筋祛湿液，按供试品溶液制备方法制备，得缺川牛膝的阴性溶液。取杯苋甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含25 μg的溶液，即得对照品溶液。

分别吸取供试品、对照药材、阴性溶液各20 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(10：1.5：0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰，白炽灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同红褐色斑点，阴性无干扰。结果见图6。

1～3.供试品；4.川牛膝对照药材；5.杯苋甾酮；6.阴性对照。

图6 川牛膝薄层色谱图

1-3.test sample； 4.SichuanAchyranthes bidentata control；5.amaranth；6.negative control.

Fig.6TLCofCyathulaofficinaliskuam

2 高效液相色谱(HPLC)法测定粉防己碱

2.1仪器与试药 Agilent1260(美国安捷伦科技有限公司)，Agilent1260 series(色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司)，DAD检测器(型号：G4212-60008)，XS205电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)，CH-250 型超声波清洗机(天津恒奥科技公司)，粉防己碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110711-200708，含量≥99%)，其余试剂均为分析纯。

2.2方法与结果

2.2.1色谱条件 Agilent C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流动相：甲醇-乙腈-磷酸二氢钾(0.03 mol·L-1)(70：5：25)；流速：1.0 mL·min-1。

2.2.2对照品溶液的制备 取粉防己碱适量，精密称定，置25 mL量瓶，加甲醇定容配制成粉防己碱浓度为0.62 mg· mL-1对照品母液，再稀释成所需浓度。

2.2.3供试品溶液的制备 精密量取强筋祛湿液25 mL，置水浴锅上挥干，残渣加甲醇定容至10 mL，作为供试品溶液。

2.2.4专属性考察 取除去防己后处方规定的其余药材(药品量为处方量的1/10)，按处方工艺，制成缺味阴性供试品。精密量取缺防己的强筋祛湿液25 mL，按照供试液制备的方法处理。HPLC分析结果显示粉防己碱无阴性干扰，结果见图7。

2.2.5线性关系考察 精密吸取不同浓度对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以对照品浓度(C，μg·mL-1)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线。计算并求得粉防己碱的浓度和峰面积的线性关系为：Y=4 216.1X-12.193(r=0.999 7)，浓度在0.073 8～0.246 0 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6精密度实验 精密吸取粉防己碱对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，粉防己碱平均峰面积为513.7，RSD为0.93%，表明精密度良好。

2.2.7重复性实验 取同一批供试品(批号：20150502)，每份25 mL，精密量取，按供试品溶液制备方法制备，测定含量，粉防己碱平均含量为0.10 μg·mL-1，RSD为2.5%(n=6)，结果表明重复性良好。

A.粉防己碱；B.强筋祛湿液样品；C.阴性对照。

2.2.8稳定性实验 精密吸取供试品溶液10 μL，分别于0，4，8，12，16 h，连续进样5次，测定峰面积，其平均峰面积为291.73，RSD为1.3%(<3.0%)。表明供试品溶液在16 h内稳定性较好。

2.2.9加样回收率实验 取已知粉防己碱含量的同一供试品9份，每份5 mL，精密量取，分别精密加入已知粉防己含量的50%，100%，150%对照品。按供试品溶液处理，测定含量，加样回收率在95%～105%，符合含量测定要求，该方法可行，结果见表1。

表1 粉防己碱加样回收率实验结果

2.2.10样品含量测定 量取不同批号强筋祛湿液各25 mL，按供试品处理方法处理样品。吸取样品注入高效液相色谱仪，进样量5 μL。结果见表2。

表2 强筋祛湿液含量测定结果

Table.2ContentdeterminationofQiangjinqushiye

批号取样量/mL峰面积含量/(μg·mL-1)20150501251 0550.1020150502259740.0920150503259410.09

3 讨论

笔者在本实验建立了强筋祛湿液处方中防己、延胡索、独活、何首乌、丁香、川牛膝药材的TLC鉴别和粉防己碱的含量测定方法。通过本标准，可以达到对强筋祛湿液质量的控制。

粉防己碱属于双苄基异喹啉类生物碱，是天然钙通道阻断药，具有消炎镇痛作用，被广泛应用于心血管系统和炎性疾病的防治[9-10]。粉防己碱是强筋祛湿液药效物质，治疗风湿痹痛症时可能机制是抑制炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、iNOS的释放而起到镇痛抗炎效果[11]。粉防己碱通过对心肌缺血-再灌注过程中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6的影响减轻缺血-再灌注损伤，也可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β表达[12]。并且粉防己碱可以抑制NLRP3炎性小体活化，减轻肺动脉高压大鼠肺组织炎性浸润，对肺动脉高压具有一定逆转作用[13]。乌司他丁联合粉防己碱对HIRI具有保护作用，其机制可能与抑制肝细胞脂质过氧化作用、增强体内抗氧化能力及下调肝组织中NF-κB p65表达有关[14]。由此可见，强筋祛湿液中粉防己碱对风湿痹痛的治疗是多靶点的，是该制剂的药效物质基础。

处方中延胡索、独活、何首乌、丁香、川牛膝都具有祛风湿、止痹痛、补肝肾、强筋骨作用。现代药理研究表明，延胡索、独活通过多个靶点对多种痛症具有良好的缓解效果[15-17]。何首乌具有降血脂、抗炎、增强免疫功效[18-19]。丁香及其主要成分丁香酚具有抗氧化、杀菌、解热镇痛、增强记忆、麻醉等多种药理作用[20-21]。川牛膝中的三萜皂苷对关节炎症有一定缓解作用[22-23]。

笔者在本实验中结合前期药效实验结果，选定上述药材和粉防己碱进行TLC鉴别和含量测定，能确保该制剂疗效的稳定性。