欧水平，郑小翠，陈灵，王森，3，任丽，蔡迎迎

(1.遵义医科大学附属医院药剂科，遵义 563000；2.遵义医科大学药学院，遵义 563003；3.贵州省毕节市第一人民医院药学实验室，毕节 551700)

清胰汤为遵义医科大学附属医院协定处方，现已记载于《古今名方》，该方由大黄、赤芍、木香、丹皮、厚朴、栀子、延胡索、芒硝组成，具有疏肝利胆、清热泻火、止痛通便功效。临床及实验研究表明[1-3]，清胰汤对急性胰腺炎有较好治疗作用，具有抑制胰酶活性、降低血清淀粉酶、清除肠道内毒素、防止肠道菌群移位等作用，可防止过氧化损伤，还可抑制炎症因子释放，阻断炎症连锁反应，减少胰腺损伤及并发症发生等。临床长期以煎剂给药，颗粒剂是在煎剂基础上进一步浓缩、精制而得，既保持了煎剂吸收快、作用迅速的优点，又克服了煎剂易霉变，携带、贮存不便等缺点。本实验在清胰汤提取工艺研究基础上[4]，将传统煎剂制成颗粒剂(清胰颗粒)，以颗粒剂成型率、溶化率、含水量、休止角为综合评价指标，结合单因素实验与PB(Plackett-Burman)实验设计，优选清胰浸膏粉与填充剂的配比、乙醇浓度、黏合剂浓度与用量、制粒筛目、干燥温度。清胰颗粒成分复杂，大黄泻下攻积、利湿退黄为君药，故建立高效液相色谱(HPLC)法对清胰颗粒中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量进行测定，以期为清胰颗粒的生产及质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent-1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，包括四元泵、DAD 检测器、柱温箱、自动进样器)，RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，DZF-250真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)，ME204E电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，感量：0.1 mg)，800Y型多功能不锈钢粉碎机(永康市铂殴五金制品有限公司)，BT-1000粉体综合特性测试仪(丹东百特仪器有限公司)。

1.2试药 大黄素、大黄酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110756-201512，110757-201607)，芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-17030605，MUST-17030603，MUST-17030622)，清胰浸膏粉(自制)，乳糖(上海华茂药业有限公司)，微晶纤维素101、糊精和可溶性淀粉、聚维酮K30(PVP-K30)、聚乙二醇6000 (PEG6000)、羟丙甲纤维素(HPMC 300 mPa·s)均购于安徽山河药用辅料股份有限公司，高黏度甲基纤维素(15 000 mPa·s)购于生工生物工程上海(股份)有限公司，乙醇(成都科龙化工试剂厂)，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1清胰颗粒的制备 称取处方量各药材饮片，加入10倍量65 ℃ 水浸泡30 min(除芒硝外)，煎煮3次，每次20 min，滤过，合并3次滤液[4]，将芒硝溶解于滤液中，55 ℃减压浓缩至稠浸膏，70 ℃减压干燥，干浸膏粉碎过80目筛(筛孔内径：180 μm)，即得清胰浸膏粉。称取浸膏粉与辅料，按一定比列混匀，加入一定量黏合剂，制得适宜软材，挤压过筛制粒，干燥0.5 h，过一号与四号筛(筛孔内径分别是2000与250 μm)整粒即得。

2.2颗粒评价指标的测定

2.2.1成型率测定 将制得的清胰颗粒称定质量(M)，分别过一号与四号筛，收集能过一号筛但不能过四号筛的颗粒，称质量记为(m)，成型率(%)=m/M×100%。

2.2.2溶化率测定 在干燥至恒重的离心管中加入精密称定合格清胰颗粒0.5 g，加入热水10 mL，搅拌振荡 5 min，3000 r·min-1离心10 min(离心半径r=10 cm)，弃去上清液，残渣80 ℃ 烘干至恒定质量，称定质量，平行实验3份，计算平均值，溶化率(%)=(总颗粒质量-残渣质量)/总颗粒质量×100%[5]。

2.2.3含水量测定 按照《中华人民共和国药典》2015年版通则水分测定法第二法(烘干法)[6]测定。

2.2.4休止角测定 取清胰颗粒，采用固定漏斗法，使用BT-1000型粉体综合特性测试仪，分别从3面测量圆锥体斜面与平面的夹角，取平均值即得休止角。

2.2.5吸湿率的测定 配制氯化钠(NaCl)过饱和溶液，置干燥器中，25 ℃恒温饱和24 h。称量瓶开盖，置于其中饱和24 h，精密称定质量M1，取清胰颗粒适量，平铺于称量瓶内，精密称定质量M2，放入干燥器，24 h时取出精密称定质量M24。吸湿率(%)=(M24-M2)/(M2-M1) ×100%[7]。

2.3处方筛选

2.3.1浸膏粉与填充剂配比的确定 分别将糊精与清胰浸膏粉按0.2：1，0.5：1，1：1制粒，比例为0.5：1制得颗粒成型率、溶化性较好，且清胰汤日服生药量为133 g[8]，清胰干浸膏得率约30%，考虑颗粒服用量，所以糊精与浸膏粉最大配比为0.5：1。

2.3.2填充剂的筛选 以颗粒成型率、吸湿率(24 h)、含水量、溶化性及制粒情况为考察指标，分别以乳糖、糊精、可溶性淀粉和微晶纤维素为填充剂，按填充剂与浸膏粉比为0.5：1，加入适量5.0%PVP-K30(90%乙醇为溶剂)，制粒。结果综合吸湿性、成型率、水分及制粒过程，糊精较其他3种辅料更好，故选取糊精作为辅料。

2.3.3黏合剂及浓度的确定 以90%乙醇为溶剂，分别考察浓度均为1.0%的PEG6000、PVP-K30、HPMC、高黏度甲基纤维素为黏合剂，以成型率、溶化性为评价指标，发现以PEG6000黏合剂制得颗粒成型率较高，能溶解成均匀混悬液，其他黏合剂均有不同程度白色沉淀。选择1.0%，1.3%，1.4%，1.5%，1.7%，1.8% PEG6000(90%乙醇为溶剂)为黏合剂制粒，发现所有制得颗粒均能溶解成均匀混悬液，随PEG6000浓度增加，软材黏性增强，PEG6000浓度在1.3%，1.4%，1.5%制得软材适中，过筛容易，成型率>80%。

2.3.4颗粒处方及工艺优化 根据单因素实验考察结果，考虑各因素相互影响，综合考察辅药比、乙醇体积分数、PEG6000浓度及用量、制粒筛目、干燥温度对颗粒成型率、溶化率、含水量、休止角的影响，设计因素水平见表 1。采用JMP 13.0版软件中PB设计安排实验，按“2.2”项方法对制得颗粒进行评价，结果见表2。

表1 因素与水平

采用 JMP 软件对处方及结果成型率、含水量、溶化率、休止角进行高斯过程模型拟合。成型率拟合结果表明，黏合剂用量为主效应，占0.736，主效应是模型中的函数效应与每个因子的总变异之比，各因素间交互作用对其无影响；成型率与黏合剂用量呈正相关，与干燥温度呈负相关；辅料比例对溶化率影响较大，为主效应项，占0.999，随辅料比例增大成型率增加，溶化率减小，这与糊精溶化性相符；黏合剂用量对休止角影响较大，其次是乙醇浓度，乙醇浓度或辅药比例升高，黏合剂用量越多，休止角越小，颗粒流动性越好；含水量受影响因素较多，依次分别为黏合剂用量、乙醇浓度、辅料比例与干燥温度，黏合剂用量越多、辅料越少、乙醇浓度和温度越低，含水量越高。实验设计范围内PEG浓度和制粒筛孔大小对各指标影响小，乙醇浓度及黏合剂的用量对各指标影响较大。曲面图见图1。

以成型率、溶化率最大化，休止角、含水量最小化为优化意愿，采用JMP软件预测刻画器进行预测进行优化，结果见图2。最优处方与成型工艺为：糊精与清胰浸膏粉比例为0.5：1，1.0%PEG6000的95%乙醇溶液，用量为25%，过16目筛(筛孔内径：1 190 μm)制粒，65 ℃干燥0.5 h；制得颗粒的成型率、溶化率、休止角和含水量分别为97.09%，71.23%，23.96°，6.84%，预测意愿为0.86。

2.3.5处方及工艺验证 按优化最佳工艺条件制备清胰颗粒3批，成型率、溶化率、含水量、休止角、吸湿率分别为(94.83±0.47)%，(75.15±0.44)%，(5.96±0.15)%，(22.55 °±0.22 °)，(12.78±0.33)%。可见制得颗粒成型性、流动性良好，各项指标也符合《中华人民共和国药典》2015年版要求，表明优选的处方及工艺参数稳定、可靠。

2.4颗粒临界相对湿度的测定 分别配制氯化镁、碳酸钾、溴化钠、碘化钾、氯化钠、氯化钾和硝酸钾7种过饱和盐溶液，按“2.2.5”项方法，放置8 d，测定不同时间清胰颗粒的吸湿率，以达吸湿平衡，以吸湿率为纵坐标，相对湿度为横坐标，图中曲线两端做切线，两切线交点对应的横坐标即为临界相对湿度。结果表明清胰颗粒的相对湿度为72.78%，即在生产、贮存环境湿度应控制在72.78%内，以减少湿度对清胰颗粒质量的影响。

2.5清胰颗粒中蒽醌类成分含量测定

2.5.1色谱条件 UItimate XB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，洗脱程序：0～13 min，15%→28%A；>13～15 min，28%→47%A；>15～55 min，47%→56%A；>55～60 min，56%→80%A；>60～65 min，80%→80%A；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1，检测波长：237 nm，进样量10 μL。

表2 实验设计与结果

图1 响应曲面

图2 各项评价指标预测刻画器

2.5.2溶液配制 单个对照品溶液的制备：精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品2 mg，分别置于10 mL量瓶，适量三氯甲烷溶解后加甲醇定容，即得 200 μg·mL-1单个对照品溶液。

供试品的溶液制备：精密称定清胰颗粒1 g于50 mL量瓶，加水稀释至刻度，混匀后准确吸取5 mL，加入10%盐酸5 mL水解30 min后，乙醚萃取至无色，低温挥发去乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至 5 mL，孔径0.22 μm滤膜滤过即得。取空白颗粒(不含清胰浸膏粉，由单纯的辅料组成)同法制备。

2.5.3专属性考察 分别取空白溶剂、空白颗粒、混合对照品溶液、供试品溶液，按“2.5.1”项色谱条件进样测定，得色谱图，见图3，溶剂和辅料对蒽醌类成分测定无干扰，各成分分离度良好，此方法专属性良好。

2.5.4线性关系考察 分别取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各1 mL和大黄素甲醚单个对照品溶液0.8 mL，置同一5 mL量瓶，加甲醇定容制得每毫升含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚40 μg和大黄素甲醚32 μg的混合对照品溶液。逐级稀释2倍得系列浓度混合对照品溶液。按“2.5.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程为：芦荟大黄素Y=25.382X+6.445 8(r=0.999 9)、大黄酸Y= 37.384X+25.5(r=0.999 7)、大黄素Y=25.732X+14.542(r=0.999 7)、大黄酚Y=25.405X+9.970 8(r=0.999 4)、 大黄素甲醚Y=13.082X-5.770 8(r=0.999 2)，表明芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚均在2.5～40.0 μg·mL-1、大黄素甲醚在2.0～32.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。

A.空白溶剂；B.空白颗粒；C.混合对照品；D.清胰颗粒；1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚。

图3 清胰颗粒HPLC图

A.blank solvent；B.blank granule；C.mixed reference substance；D.Qingyigranule；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion.

Fig.3HPLCchromatogramsofQingyigranule

2.5.5精密度实验 取同一供试品溶液，在色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算含量，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量RSD分别为1.68%，0.48%，2.28%，1.49%，0.66%，表明仪器精密度良好。

2.5.6重复性实验 取同一批号清胰颗粒6份，按 “2.5.2”项方法平行制备供试品溶液，进样测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量RSD分别为1.76%，1.02%，1.58%，1.97%，1.31%，表明该方法重复性良好。

2.5.7稳定性实验 取同一供试品溶液，室温下分别于0，2，4，8，15，24 h进行测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量RSD分别为1.45%，1.36%，1.27%，2.62%，2.62%，表明供试品溶液室温条件下24 h内稳定。

2.5.8加样回收率实验 精密称取已知含量的清胰颗粒9份，分别加入相当于样品含量50%，100%，150%对照品各 3 份，按“2.5.2”项方法制备供试品溶液，进样测定，计算平均回收率，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚回收率分别为100.42%、97.82%、97.54%、98.03%、99.95%，RSD分别为2.55%、1.73%、1.49%、2.15%、1.47%。

2.5.9样品的含量测定 取清胰颗粒3批，按供试品溶液制备和测定方法，对样品进行制备和含量测定，计算各有效成分含量，结果见表3。

表3 清胰颗粒中5种有效成分的含量

Table.3ContentsoffiveactivecomponentsinQingyiparticlesmg·g-1

有效成分测量次数123平均含量RSD/%芦荟大黄素0.550.550.550.550.80大黄酸0.910.930.940.931.42大黄素0.640.650.650.650.61大黄酚0.690.720.710.711.70大黄素甲醚0.460.470.460.461.02

3 讨论

对于急性胰腺炎，肠内营养治疗可缓解患者炎症反应，抑制肠道菌群移位，改善症状，提升治疗效果[9-11]。麦芽糖糊精多作为肠内营养制剂成分[12]。由于急性胰腺炎患者胰岛内分泌功能可能受破坏，为防止葡萄糖迅速释放和吸收，减少对胰岛素的依赖，因此选择糊精作为填充剂，将清胰颗粒制备成无糖颗粒。

芒硝与清胰浸膏粉有较强吸湿性，难制粒，需加入辅料以降低吸湿性。乳糖抗吸湿性强，黏性弱，流动性好，制得颗粒细粉多，成型率低。急性胰腺炎患者胰岛可能受损，胰岛素分泌降低，用乳糖作为填充剂增加胰腺负担。微晶纤维素也具有较好抗吸湿性，由于本身不溶于水，使得颗粒溶化性较差。因而选择综合较好的糊精作为填充剂。吸湿性：芒硝>清胰浸膏粉>填充剂，三者混合顺序直接影响混合后物料的吸湿性，进而影响颗粒制粒难易程度及成型率。将芒硝溶于清胰提取液，然后浓缩干燥，得到浸膏粉，将其再与辅料混合，制得软材适中，颗粒外观均匀。

制备颗粒剂时，乙醇浓度的选择也较重要。乙醇浓度较低，在混合、制粒时较易结块，难过筛，若乙醇浓度越高，其挥发越快，使得所制颗粒易碎而不易成型。故本实验选用95%乙醇为溶剂制备黏合剂，以达到降低吸湿性、增加黏性的效果，从而提高成型率。由于乙醇浓度较高，加入后搅拌时间过长会导致黏合剂中乙醇挥发，剩下的水引湿性太强，导致软材湿黏发硬结块不易制粒。高浓度乙醇制粒后缩短干燥时间，避免长时间干燥造成药效成分损失。

清胰颗粒成分复杂，大黄是清胰汤的君药，也是治疗急性胰腺炎的公认药物[13]，大黄主要有效成分是蒽醌类物质，后者具有较好抗炎作用[14]。因此，笔者在本实验采用HPLC法，对优化工艺条件下制得的清胰颗粒中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚进行含量测定，为清胰颗粒的生产及质量控制提供参考。