任梦娟 ，史宏志*，杨明坤，周骏，刘百战，杨惠娟，白若石，李洪亮，毕艳玖，李耕

1 河南农业大学烟草学院/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，郑州 450002；2 上海烟草集团有限责任公司，上海 200082；3 河南省烟草公司许昌市公司襄城县分公司，河南许昌 461700

烟碱是烟叶中主要的活性成分，不仅直接影响烟叶的生理强度，也是使人产生致瘾性的主要成分[1-2]。Benowitz 等于1994 年首先提出把烟叶烟碱含量降至使人致瘾的临界值以下，可有效减少吸烟者对烟草的依赖性的理念[3]，并开展了大量相关研究[4-7]。世界卫生组织（WHO）为了降低吸烟率，2015 年建议将卷烟烟丝中的烟碱含量降至0.4 mg/g 以下[8]，低于维持上瘾所需的阈值[3]。美国食品和药品管理局 （FDA）2018 年颁布了控制烟碱含量的监管意见草案（ANPRM），提出可燃香烟具体潜在的烟碱水平为：0.3，0.4 和0.5 mg/g 的标准[9]，目前正考虑制订强制性标准降低可燃香烟中的烟碱含量至不使人致瘾的水平[10]。受ANPRM 影响，低/超低烟碱含量烟草的生产和论证成为国际烟草科技领域研究的新热点。目前虽然可通过遗传育种、遗传工程、农艺调控和化学萃取等途径在一定程度上实现低/超低烟碱含量烟叶生产，但能否大规模投入使用尚存在不确定性[11]。烟碱是烟叶和烟气中重要的具有生理活性的化学成分，大幅度降低烟碱含量对烟叶化学组成和感官质量会产生显著影响，且不同来源的低烟碱烟叶对感官质量的影响不同[12-18]。由于烟碱和其他生物碱也是烟草特有亚硝胺 （Tobacco-specific nitrosamines, TSNAs）的直接前体物，烟叶中烟草生物碱和TSNAs 有直接的相关关系[19-21]。烟叶中烟碱含量的大幅度降低可能对TSNA 形成产生显著的影响[22]。

嫁接栽培技术已被广泛应用于瓜果、蔬菜种植上，能够提高产量、改善品质、提高植物抗性、促进养分吸收等[23-24]。嫁接可延缓烟草青枯病的发生，降低发病率和病情指数，提高烟株的产量、产值和均价[25]。以烟草为接穗嫁接到茄子上的嫁接苗青枯病的抗性明显提高[26]，本课题组于2017 年通过烟茄嫁接生产出的极低烟碱的烟叶，蛋白质、淀粉、总氮含量增加，总糖、还原糖含量降低[27]。但以烟茄嫁接生产的超低烟碱烟叶的感官质量、消费者反应及减害效果等影响尚不清楚。本研究以烟茄嫁接（烤烟为接穗，同科的茄子为砧木）获得的超低烟碱含量烟叶为材料，探究了在通过嫁接技术选择性降低烟碱含量对烟叶TSNAs、中性香气物质含量的影响，并以不同处理烟叶卷制单料烟进行烟气参数测定和感官质量评价，旨在明晰超低烟碱含量烟叶对烟叶和烟气化学组成和感官质量的影响，为超低烟碱含量烟叶生产可行性分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

本试验于2017 年在河南省许昌市襄城县王洛镇王洛烟站，试验材料：以青皮茄子（Solanum melongena L.）为砧木、烤烟云烟87 为接穗，采用盆栽试验。土壤类型：沙壤土，土和烟草专用育苗基质按1 : 1 重量均匀混合，每盆装土10 kg。供试肥料为烟草育苗专用营养液，氮：磷：钾为2 : 1 : 2。

1.2 试验设计与方法

采用嫁接剪法，选择长有5～6 片真叶且茎部没有木质化的烟苗和茄子苗进行嫁接，利用嫁接剪剪下接穗，取烟草顶端2 叶一心或3 叶一心作为接穗，砧木距茄子苗根部5 cm 左右剪切，然后将接穗插入砧木切口中，用拇指和食指轻轻压平，最后用嫁接夹固定。每个处理组合嫁接40 株，嫁接苗进行避光保温保湿，前3 d 相对湿度90%左右，之后相对湿度80%左右，3 d 之后见光，7 d 后进行正常管理，15 d 后去掉嫁接夹。试验嫁接组合：云烟87/云烟87、云烟87/茄子。试验嫁接苗6 月9 日移栽，8 月8 日打顶，移栽15 d 后，选10 株长势一致的烟茄嫁接组合进行培土，培土高度超过嫁接口5 cm，使其烟株茎秆产生不定根。

试验采用盆栽方式，共设3 个处理，3 次重复，共9 个样品。处理1：接穗与砧木都为云烟87，用“烟/烟”表示；处理2：云烟87 为接穗，茄子为砧木不进行培土，用“烟/茄不培土”表示；处理3：云烟87 为接穗，茄子为砧木并对烟株进行培土且培土高度高于嫁接口5 cm，用“烟/茄培土”表示。每个处理选择10 株，3 次重复，共90 株嫁接烟株。

1.3 样品制备

烟叶正常成熟采收，各处理选取中部（第7～14叶位）、上部（第15～20 叶位），编竿后挂牌标记，采用三段式烘烤工艺烘烤。各处理调制后的混合烟叶切丝，一部分卷制成试验卷烟，用于卷烟烟气成分测定和感官质量评价；一部分烟丝于50℃烘干、研磨，过60 目筛，进行香气及TSNAs 含量的测定。

1.4 测试项目和方法

1.4.1 TSNAs 的测定

样品在上海烟草集团北京卷烟厂进行 TSNAs测定。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPELC-MS/MS） 法（SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis （Pico）；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。称 1.0 g 烟样，放入 50 mL 锥形瓶中，加 40 μL 4 种氘代 TSNAs（内标）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L 乙酸铵水溶液，室温下振荡（200 r/min）萃取 60 min，萃取液过 0. 45 μm 水相滤膜，LC-MS/MS 检 测 TSNAs[28]。 总 TSNAs 是 NNN、NNK、 NAT 和 NAB 的含量之和。

1.4.2 卷烟烟气的测定

样品在上海烟草集团北京卷烟厂进行卷烟烟气的测定。用φ44 mm 剑桥滤片逐口捕集30 支卷烟的主流烟气总粒相物，分别按照GB/T 19609-2004[29]、GB/T 23355-2009[30]、GB/T 23203.1-2008[31]、GB/T 23356-2009[32]和GB/T 21130-2007[33]的方法测定烟气中的焦油、烟碱、水分、CO。

1.4.3 中性香气物质的测定

采用上海烟草集团技术中心改进的正己烷常温萃取前处理方法和LC-GC 方法[34]测定茄酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、氧化紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮（1、2、3、4）、3-羟基-β-二氢大马酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、新植二烯、3-羟基索拉韦惕酮和法尼基丙酮14 种香气物质的含量。称取烟末样品 0.20g 于 15 mL 螺口试管内，加 5 mL 正己烷和 200 μL α-紫罗兰酮内标溶液（11.2 µg/mL），涡旋振荡 1 min，静置24 h，再次涡旋振荡，3000 r/min 离心 10 min，取上清液 1～1.5 mL 至色谱样品瓶待测。

1.4.4 感官质量评价

将各处理挑选的中部叶和上部叶的样品去梗后进行切丝卷制单料烟，由河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地、河南中烟工业有限责任公司评吸专家分别对其进行感官质量评价，按照香气质、香气量、杂气、浓度、劲头、刺激性、余味、燃烧性进行感官质量评价，并对满足感、愉悦感、接受度3 个单项指标打分。

1.5 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS17.0 软件进行数据统计分析。采用Duncan 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 烟茄嫁接对烟叶和烟气有害成分含量的影响

2.1.1 烟茄嫁接对烤后烟叶TSNAs 含量的影响

如表1 所示。烟茄嫁接中、上部烟叶的NNN、NAT、NAB、NNK 及TSNAs 含 量 与 烟/ 烟 对 照相比存在显著性差异，其中NNN、NAT、NNK 及TSNAs 含量变化规律一致，烟/茄不培土处理最低，烟/烟处理最高，上部叶烟/茄不培土处理的NNN、NNK 及TSNAs 含 量 比 烟/ 烟 低82.71%、79.46% 和68.78%，中部叶烟/ 茄不培土处理的NNN、NNK 及TSNAs 含 量 比 烟/ 烟 低79.68%、79.80%和68.63%；NAB 含量变化为烟/茄培土＞烟/茄不培土＞烟/烟，上部叶烟/茄培土比烟/烟高60.10%，中部叶烟/茄培土比烟/烟高60.27%。总TSNAs 含量降低主要是由NNN 和NNK 含量的降低引起的。

表1 烟茄嫁接对烤后烟TSNAs 含量的影响Tab. 1 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of TSNAs in flue-cured tobacco

2.1.2 烟茄嫁接对卷烟烟气成分含量的影响

不同处理卷烟烟气有害成分释放量的高低在较大程度上反映了烟丝中有害成分或前体物含量的高低，如表2 所示。烟/茄不培土、烟/茄培土和烟/烟3 个处理间的卷烟抽吸口数、烟气中总粒相物、焦油和一氧化碳的释放量无显著性差异，总粒相物、焦油和一氧化碳释放量及抽吸口数表现为烟/烟＞烟/茄培土＞烟/茄不培土；烟/茄不培土和烟/茄培土的烟碱释放量显著低于烟/烟处理，烟/茄不培土、烟/茄培土分别比烟/烟低94.12%和92.66%。结果表明烟茄嫁接可较大程度调控卷烟烟气中烟碱释放量。

表2 烟茄嫁接对卷烟烟气成分含量的影响Tab. 2 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of composition in mainstream cigarette smoke

2.2 烟茄嫁接对烤后烟中部叶中性香气物质含量的影响

如表3 所示。除巨豆三烯酮2 外，各处理香气物质含量差异达显著水平，烟/茄不培土和烟/茄培土烟叶中茄酮、香叶基丙酮、氧化紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和3-羟基索拉韦惕酮等香气物质含量显著增加，烟/茄不培土和烟/茄培土烟叶中β-紫罗兰酮、3-羟基-β-二氢大马酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、新植二烯、巨豆三烯酮（1、3、4）和bet-法尼烯等香气物质含量及香气物质总量显著降低，其中烟/茄不培土与烟/烟处理的香气物质总量无显著性差异，烟/茄培土与烟/烟处理的香气物质总量有显著性差异。

表3 烟茄嫁接对烤后烟中部叶中性香气成分含量的影响Tab. 3 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of neutral aroma components in middle tobacco leaves

2.3 烟茄嫁接对烤后烟感官质量和消费者反应的影响

2.3.1 烟茄嫁接对烤后烟感官质量的影响

感官评吸可以直接、准确地评价出烟叶及其制品质量的优劣。如图1、图2 所示，烟茄嫁接对烤后烟中、上部叶感官品质的影响效果基本一致，烟/茄培土、烟/茄不培土处理与对照烟/烟处理相比，香气质、浓度、余味、刺激性和燃烧性无显著差异，香气量、杂气、劲头显著降低，但仍能感知到一定程度的劲头。

图1 烟茄嫁接对烤后烟上部叶感官质量的影响Fig. 1 Effect of tobacco and eggplant grafting on sensory quality in upper tobacco leaves

图2 烟茄嫁接对烤后烟中部叶感官质量的影响Fig. 2 Effect of tobacco and eggplant grafting on sensory quality in middle tobacco leaves

2.3.2 烟茄嫁接对消费者反应的影响

如图3 所示，烟茄嫁接的烤后烟中、上部叶对消费者反应的影响效果基本一致，与对照烟/烟处理相比，烟/茄培土与烟/茄不培土处理的满足感、愉悦感、接受度显著降低，且烟/茄培土与烟/茄不培土两处理间满足感、愉悦感、接受度的分值基本一致。结果表明，烟茄嫁接生产的超低烟碱烟叶对消费者反应有显著影响。

图3 烟茄嫁接对消费者反应的影响Fig. 3 Effect of tobacco and eggplant grafting on response of smoker

3 讨论

普通烟草的生物碱以烟碱为主，占总生物碱含量的93%以上[35]。前期研究通过烟茄嫁接可将烟叶烟碱含量降至极低水平，鲜烟叶中烟碱含量低至0.08%，烤后烟烟叶烟碱含量低至0.09%，比烟/烟降低94.81%，且通过培土诱发不定根产生可以有效调控烟茄嫁接烟叶的烟碱含量[27]。上世纪Dawson 在番茄上嫁接的烟草虽然烟碱含量很低，但确能合成部分烟碱，然后用同位素3H 标记的盐酸注射嫁接的接口部位，证明接穗与砧木的结合部位确能合成烟碱[36,37]。所以我们初步认为烟茄嫁接烟叶中的少量烟碱可能来自于接穗基部的嫁接部位。大量资料显示烟苗幼苗烟碱含量在0.3%～0.4%左右[38]，前期研究分别在嫁接后65 d 和80 d 取样测定烟碱含量分别为0.0834%、0.0804%[27]。有研究表明烟碱在生物体内的半衰期为22 h，Yoshida 用15N标记烟碱注入不同发育阶段烟草体内，两周后发现幼小植株体内80%以上标记的烟碱被降解[39-41]。因此嫁接后的成熟烟叶这部分烟碱可能不是来自于烟草幼苗的积累，具体原因需要进一步深入研究验证。TSNAs 是烟草生物碱发生硝化反应的产物，在烟叶硝态氮含量和调制环境相同的条件下，烟叶烟碱、降烟碱含量与NNN 和TSNAs 含量呈极显著的正相关关系[42]。本研究结果表明，烟茄嫁接后随着烟碱含量的大幅度降低，NNN、NNK、NAT 和TSNAs 含量显著降低；而NAB 含量显著增加，这可能与嫁接烟叶的假木贼碱含量没有与烟碱含量同步下降，且占总生物碱含量的比例显著增加有关[27]。前期研究烟茄嫁接烟叶烟碱含量降低94%左右，但是TSNAs 含量并没有同比例下降，具体原因需要进一步研究探索，可能是烟叶在生物碱水平较低的情况下，TSNAs 的合成效率比较高。

香气是反应烟叶质量的重要品质因素，是评定烟叶及其制品品质的重要指标，烟草香气物质的代谢包括香气前体物的合成、降解，香气成分的形成、转化等过程，中性挥发性香气成分对烟叶香气品质有重要贡献[43]。烟叶烟碱和总氮含量是烟叶内在质量和感官质量的主要影响因子, 烤烟烟碱含量与烟叶香味品质和中性香气物质含量呈显著正相关，烟碱含量降低导致烟叶生理强度（劲头）和满足感下降，香气量减少[16,17,41]。基于常规育种和化学萃取的超低烟碱烟叶的品质性状不良,烟叶感官质量显著下降，难以在卷烟配方中使用，消费者接受程度降低[12,13]。而杜咏梅等[44]则认为烟碱为目前制约烤烟吸味品质的主要化学成分，降低烟碱能有效提高烤烟吸味品质。本研究结果表明，烟茄嫁接生产的超低烟碱烟叶的茄酮、巨豆三烯酮等香气物质含量变化较小，烟叶的香气物质较丰富，烟气浓度、刺激性和余味等变化较小，但香气量、劲头显著降低，吸烟者的满足感、愉悦感、接受度显著降低，这与大多数研究结果是基本一致的[16, 17, 41]。

4 结论

烟茄嫁接的超低烟碱烟叶，中性香气物质含量变化较小，NNN、NNK、NAT 和TSNAs 含量及卷烟烟气中烟碱的含量大幅降低，卷烟烟气焦油、CO 和总粒相物等参数影响相对较小；烟气劲头下降明显，香气量有所减少，香气质、烟气浓度、余味、燃烧性和刺激性无显著差异；消费者满足感和愉悦感显著降低。